UZH-Logo

Maintenance Infos

Functional and structural analysis of the activation mechanism of Caspase-8


Keller, N. Functional and structural analysis of the activation mechanism of Caspase-8. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Human caspase-8 is an enzyme involved in apoptosis, a process essential to
remove unwanted or diseased cells throughout the life of multicellular organisms.
Initially caspase-8 is produced in the cell as the monomeric latent
precursor procaspase-8 comprising an N-terminal prodomain with two death
effector domains followed by a catalytic domain that contains two subunits
connected by a 40 amino acid linker. The catalytic domain harbors the substrate
binding pocket and the active site residue cysteine. Activation of the
enzyme occurs upon binding of the zymogen to the macromolecular death
inducing signaling complex, DISC. This binding is facilitated by homotypic
death effector domain interactions between the prodomain of procaspase-8
and the adapter protein FADD. Bound to the DISC procaspase-8 becomes
activated by dimerization and subsequent proteolytic processing.
This thesis analyzes the activation mechanism of caspase-8 in more detail
using biochemical and biophysical as well as structural methods. Thereby,
chapter 2 focuses on the prodomain and its binding to FADD whereas chapters
3 and 4 analyze the structural changes occurring within the catalytic
domain of caspase-8.
The determinants for binding of procaspase-8 prodomain to FADD were
analyzed using pull-down experiments. It was shown that FADD binding
depends on the complete prodomain since individual death effector domains
were not able to bind FADD. During purification and pull-down experiments
an additional oligomerization of the prodomains was evident. An initial
hypothesis stated that this oligomerization is cysteine dependent. However,
mutation of two cysteins in the second death effector domain of the
prodomain of caspase-8 could not confirm this, neither with pull-down experiments nor in cell biological assays.
Preliminary studies using fusion tagged caspase-8 prodomain and FADD
were conducted to form a complex between FADD and the caspase-8 prodomain
for biochemical and structural studies. However, current problems
include a high aggregation tendency of the proteins and the presence of
large fusion tags, which might hamper structure determination. Therefore,
a discussion in chapter 2.3 includes several strategies to circumvent these
problems in future experiments.
Whereas structure determination of the prodomain proved to be difficult the
structure of the catalytic domain of the caspase-8 zymogen, procaspase-8 was
determined by solution NMR. Whereas the secondary structure elements of
procaspase-8 resemble the ones of active caspase-8 significant differences were
observed in the loops surrounding the substrate binding pocket and the linker
connecting the two subunits. Biochemical and biophysical analyses on a set
of various dimerization and processing mutants were performed to elucidate
the transition from monomeric procaspase-8 to active dimeric caspase-8 and
the influence of inhibitor binding. These studies clearly confirm the requirement
of dimerization for caspase-8 activity in unprocessed but also processed
form by inducing structural changes around the active site. In addition, it
was shown that dimerization is important for activation of the enzyme by
relocating the intersubunit linker, which in procaspase-8 covers part of the
substrate binding region, into close proximity of the active site of the associated
protomer thus allowing intermolecular cleavage within the dimer.
Processing has to occur at both cleavage sites within the linker to achieve
full caspase-8 activity. After processing structural rearrangements in the active
site forming loops and the cleaved linker fragments occur resulting in
a preformed active site. Upon substrate binding this region then undergoes
additional changes to accommodate the substrate.
This work clearly confirms the importance of dimerization for activation and
activity of caspase-8. Furthermore, it highlights the additional importance
of proteolytic processing for the activation process. Thus the here described
data allow a refinement of the previous model for caspase-8 activation and
most likely provides insights into the activation mechanism of other caspases.

Das Enzym Caspase-8 spielt eine ausschlaggebende Rolle in der Apoptose,
einem Prozess welcher für die Eliminierung von kranken oder überschüsssigen
Zellen in mehrzelligen Organismen verantwortlich ist. In der Zelle
wird Caspase-8 zunächst als inaktives Zymogen, sogenannte Procaspase-
8, produziert. In dieser Form besteht das Enzym aus einer N-terminalen
Prodomäne mit zwei Todeseffektordomänen und einer C-terminalen katalytischen
Domäne, welche in zwei Untereinheiten unterteilt ist und die Substratbingungsstelle
und das katalytische Cystein enthält. Die Aktivierung
von Caspase-8 erfolgt durch Bindung der Prodomäne an das Adapterprotein
FADD welches Teil eines hochmolekularen Komplexes genannt DISC (death
inducing signaling complex) ist. Dort wird durch Dimerisierung und proteolytische
Spaltung das aktive Enzym gebildet.
Diese Doktorarbeit beschreibt biochemische, biophysikalische und strukturelle
Experimente zur Untersuchung des detailierten Aktivierungsmechanismus
der Caspase-8. Im Wesentlichen enthält diese Arbeit zwei Hauptteile: Im
Kapitel 2 wird die Interaktion zwischen der Prodomäne und FADD genauer
analysiert, während in den Kapiteln 3 und 4 die strukturellen Änderungen
in der katalytischen Domäne während des Aktiverungsprozesses genauer untersucht
werden.
Die Bindung zwischen der Prodomäne der Caspase-8 und FADD wurde
durch biochemische Interaktionsstudien analysiert. Darin wurde gezeigt,
dass beide Todeseffektordomänen der Prodomäne benötig werden um FADD
zu binden, da keine Bindung durch individuelle Todeseffektordomänen erfolgte.
Während der Proteinreinigung und der Interaktionsstudien wurde
wiederholt eine Oligomerisation der Prodomäne beobachtet, welche ursprünglich auf die Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen den Prodomänen zurückgeführt
wurde. Mutation von zwei Cysteinen in der zweiten Todeseffektordomäne
zeigte allerdings, dass dieses Phenomän nicht cysteinabhängig und
höchstwahrscheinlich biologisch nicht relevant ist.
Erste Versuche zur Expression und Reinigung eines Komplexes bestehend aus
Prodomäne und FADD für biochemische und strukturelle Charakterisierungen
wurden durchgeführt. Allerdings wurden diese Experimente durch eine
hohe Tendenz der Prodomäne zur Aggregation und das Vorhandensein von
grossen Fusionsdomänen an der Prodomäne und am FADD erschwert. Eine
ausführliche Diskussion im Kapitel 2.3 beschreibt verschiedene Strategien,
diese Probleme in zukünftigen Experimenten zu bewältigen.
Während die Strukturbestimmung der Prodomäne bis jetzt nicht erfolgreich
war, wurde die Struktur der katalytischen Domäne der inaktiven Procaspase-
8 mittels Kernresonanzspektroskopie bestimmt. Diese Struktur zeigt, dass
die Sekundärstrukturelemente der Procaspase-8 im Vergleich zur Caspase-8
konserviert sind. Unterschiede zwischen den beiden Strukturen sind in den
Loops um die Substratbindungsstelle und dem Linker zwischen den Untereinheiten
der katalytischen Domäne zu finden. Biochemische und biophysikalische
Analysen an verschiedenen Dimerisierungs- und Prozessierungsmutanten
erlauben Einblicke in den strukturellen Übergang von der Procaspase-8
zur Caspase-8 und die Substatbindung an das Enzym. Diese Experimente
deuten darauf hin, dass Dimerisierung eine Umlagerung des Linkers herbeiführt.
In monomerer Procaspase-8 bedeckt ein Teil des Linkers die Stelle,
an welcher die Substratbindungstasche in der aktiven Caspase-8 gebildet
wird. Durch die Dimerisierung wird die Position des Linkers so umgelagert,
dass dessen Prozessierungsstellen in die Nähe des katalytischen Cysteins des
zweiten Caspase-8 Moleküles vom gleichen Dimer rücken und somit intermolekulare
Spaltung innerhalb des Dimers ermöglicht wird. Dabei ist es
wichtig, dass die Caspase-8 an beiden Prozessierungsstellen gespalten wird,
um die volle Aktivität des Enzyms zu erhalten. Nach der Spaltung erfolgen
strukturelle Änderungen in den Loops an der Substratbindungsstelle und den
gespaltenen Linkerfragmenten. Dadurch wird die Substratbindungstasche
teilweise ausgebildet. Weitere Umlagerungen zur vollständigen Bildung der
Bindungstasche erfolgen während der Substratbindung.
Diese Arbeit bestätigt den Einfluss der Dimerisierung auf die Aktivierung
und Aktivität der Caspase-8. Zusätzlich wird deutlich gemacht, dass proteolytische
Spaltung eine massgebliche Rolle im Aktivierungsprozess spielt.
Die präsentierten Ergebnisse erlauben ein tieferes Verständniss des derzeitigen
Aktivierungsmechanismusses der Caspase-8 und möglicherweise anderer Caspasen.

Human caspase-8 is an enzyme involved in apoptosis, a process essential to
remove unwanted or diseased cells throughout the life of multicellular organisms.
Initially caspase-8 is produced in the cell as the monomeric latent
precursor procaspase-8 comprising an N-terminal prodomain with two death
effector domains followed by a catalytic domain that contains two subunits
connected by a 40 amino acid linker. The catalytic domain harbors the substrate
binding pocket and the active site residue cysteine. Activation of the
enzyme occurs upon binding of the zymogen to the macromolecular death
inducing signaling complex, DISC. This binding is facilitated by homotypic
death effector domain interactions between the prodomain of procaspase-8
and the adapter protein FADD. Bound to the DISC procaspase-8 becomes
activated by dimerization and subsequent proteolytic processing.
This thesis analyzes the activation mechanism of caspase-8 in more detail
using biochemical and biophysical as well as structural methods. Thereby,
chapter 2 focuses on the prodomain and its binding to FADD whereas chapters
3 and 4 analyze the structural changes occurring within the catalytic
domain of caspase-8.
The determinants for binding of procaspase-8 prodomain to FADD were
analyzed using pull-down experiments. It was shown that FADD binding
depends on the complete prodomain since individual death effector domains
were not able to bind FADD. During purification and pull-down experiments
an additional oligomerization of the prodomains was evident. An initial
hypothesis stated that this oligomerization is cysteine dependent. However,
mutation of two cysteins in the second death effector domain of the
prodomain of caspase-8 could not confirm this, neither with pull-down experiments nor in cell biological assays.
Preliminary studies using fusion tagged caspase-8 prodomain and FADD
were conducted to form a complex between FADD and the caspase-8 prodomain
for biochemical and structural studies. However, current problems
include a high aggregation tendency of the proteins and the presence of
large fusion tags, which might hamper structure determination. Therefore,
a discussion in chapter 2.3 includes several strategies to circumvent these
problems in future experiments.
Whereas structure determination of the prodomain proved to be difficult the
structure of the catalytic domain of the caspase-8 zymogen, procaspase-8 was
determined by solution NMR. Whereas the secondary structure elements of
procaspase-8 resemble the ones of active caspase-8 significant differences were
observed in the loops surrounding the substrate binding pocket and the linker
connecting the two subunits. Biochemical and biophysical analyses on a set
of various dimerization and processing mutants were performed to elucidate
the transition from monomeric procaspase-8 to active dimeric caspase-8 and
the influence of inhibitor binding. These studies clearly confirm the requirement
of dimerization for caspase-8 activity in unprocessed but also processed
form by inducing structural changes around the active site. In addition, it
was shown that dimerization is important for activation of the enzyme by
relocating the intersubunit linker, which in procaspase-8 covers part of the
substrate binding region, into close proximity of the active site of the associated
protomer thus allowing intermolecular cleavage within the dimer.
Processing has to occur at both cleavage sites within the linker to achieve
full caspase-8 activity. After processing structural rearrangements in the active
site forming loops and the cleaved linker fragments occur resulting in
a preformed active site. Upon substrate binding this region then undergoes
additional changes to accommodate the substrate.
This work clearly confirms the importance of dimerization for activation and
activity of caspase-8. Furthermore, it highlights the additional importance
of proteolytic processing for the activation process. Thus the here described
data allow a refinement of the previous model for caspase-8 activation and
most likely provides insights into the activation mechanism of other caspases.

Das Enzym Caspase-8 spielt eine ausschlaggebende Rolle in der Apoptose,
einem Prozess welcher für die Eliminierung von kranken oder überschüsssigen
Zellen in mehrzelligen Organismen verantwortlich ist. In der Zelle
wird Caspase-8 zunächst als inaktives Zymogen, sogenannte Procaspase-
8, produziert. In dieser Form besteht das Enzym aus einer N-terminalen
Prodomäne mit zwei Todeseffektordomänen und einer C-terminalen katalytischen
Domäne, welche in zwei Untereinheiten unterteilt ist und die Substratbingungsstelle
und das katalytische Cystein enthält. Die Aktivierung
von Caspase-8 erfolgt durch Bindung der Prodomäne an das Adapterprotein
FADD welches Teil eines hochmolekularen Komplexes genannt DISC (death
inducing signaling complex) ist. Dort wird durch Dimerisierung und proteolytische
Spaltung das aktive Enzym gebildet.
Diese Doktorarbeit beschreibt biochemische, biophysikalische und strukturelle
Experimente zur Untersuchung des detailierten Aktivierungsmechanismus
der Caspase-8. Im Wesentlichen enthält diese Arbeit zwei Hauptteile: Im
Kapitel 2 wird die Interaktion zwischen der Prodomäne und FADD genauer
analysiert, während in den Kapiteln 3 und 4 die strukturellen Änderungen
in der katalytischen Domäne während des Aktiverungsprozesses genauer untersucht
werden.
Die Bindung zwischen der Prodomäne der Caspase-8 und FADD wurde
durch biochemische Interaktionsstudien analysiert. Darin wurde gezeigt,
dass beide Todeseffektordomänen der Prodomäne benötig werden um FADD
zu binden, da keine Bindung durch individuelle Todeseffektordomänen erfolgte.
Während der Proteinreinigung und der Interaktionsstudien wurde
wiederholt eine Oligomerisation der Prodomäne beobachtet, welche ursprünglich auf die Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen den Prodomänen zurückgeführt
wurde. Mutation von zwei Cysteinen in der zweiten Todeseffektordomäne
zeigte allerdings, dass dieses Phenomän nicht cysteinabhängig und
höchstwahrscheinlich biologisch nicht relevant ist.
Erste Versuche zur Expression und Reinigung eines Komplexes bestehend aus
Prodomäne und FADD für biochemische und strukturelle Charakterisierungen
wurden durchgeführt. Allerdings wurden diese Experimente durch eine
hohe Tendenz der Prodomäne zur Aggregation und das Vorhandensein von
grossen Fusionsdomänen an der Prodomäne und am FADD erschwert. Eine
ausführliche Diskussion im Kapitel 2.3 beschreibt verschiedene Strategien,
diese Probleme in zukünftigen Experimenten zu bewältigen.
Während die Strukturbestimmung der Prodomäne bis jetzt nicht erfolgreich
war, wurde die Struktur der katalytischen Domäne der inaktiven Procaspase-
8 mittels Kernresonanzspektroskopie bestimmt. Diese Struktur zeigt, dass
die Sekundärstrukturelemente der Procaspase-8 im Vergleich zur Caspase-8
konserviert sind. Unterschiede zwischen den beiden Strukturen sind in den
Loops um die Substratbindungsstelle und dem Linker zwischen den Untereinheiten
der katalytischen Domäne zu finden. Biochemische und biophysikalische
Analysen an verschiedenen Dimerisierungs- und Prozessierungsmutanten
erlauben Einblicke in den strukturellen Übergang von der Procaspase-8
zur Caspase-8 und die Substatbindung an das Enzym. Diese Experimente
deuten darauf hin, dass Dimerisierung eine Umlagerung des Linkers herbeiführt.
In monomerer Procaspase-8 bedeckt ein Teil des Linkers die Stelle,
an welcher die Substratbindungstasche in der aktiven Caspase-8 gebildet
wird. Durch die Dimerisierung wird die Position des Linkers so umgelagert,
dass dessen Prozessierungsstellen in die Nähe des katalytischen Cysteins des
zweiten Caspase-8 Moleküles vom gleichen Dimer rücken und somit intermolekulare
Spaltung innerhalb des Dimers ermöglicht wird. Dabei ist es
wichtig, dass die Caspase-8 an beiden Prozessierungsstellen gespalten wird,
um die volle Aktivität des Enzyms zu erhalten. Nach der Spaltung erfolgen
strukturelle Änderungen in den Loops an der Substratbindungsstelle und den
gespaltenen Linkerfragmenten. Dadurch wird die Substratbindungstasche
teilweise ausgebildet. Weitere Umlagerungen zur vollständigen Bildung der
Bindungstasche erfolgen während der Substratbindung.
Diese Arbeit bestätigt den Einfluss der Dimerisierung auf die Aktivierung
und Aktivität der Caspase-8. Zusätzlich wird deutlich gemacht, dass proteolytische
Spaltung eine massgebliche Rolle im Aktivierungsprozess spielt.
Die präsentierten Ergebnisse erlauben ein tieferes Verständniss des derzeitigen
Aktivierungsmechanismusses der Caspase-8 und möglicherweise anderer Caspasen.

Downloads

593 downloads since deposited on 14 Jan 2010
127 downloads since 12 months
Detailed statistics

Additional indexing

Item Type:Dissertation
Referees:Grütter M G, Hengartner M
Communities & Collections:04 Faculty of Medicine > Department of Biochemistry
07 Faculty of Science > Department of Biochemistry
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Date:10 July 2009
Deposited On:14 Jan 2010 11:55
Last Modified:05 Apr 2016 13:42
Number of Pages:142
Related URLs:http://opac.nebis.ch/F/?local_base=NEBIS&con_lng=GER&func=find-b&find_code=SYS&request=005909422
Permanent URL: https://doi.org/10.5167/uzh-26729

Download

[img]
Preview
Filetype: PDF
Size: 31MB

TrendTerms

TrendTerms displays relevant terms of the abstract of this publication and related documents on a map. The terms and their relations were extracted from ZORA using word statistics. Their timelines are taken from ZORA as well. The bubble size of a term is proportional to the number of documents where the term occurs. Red, orange, yellow and green colors are used for terms that occur in the current document; red indicates high interlinkedness of a term with other terms, orange, yellow and green decreasing interlinkedness. Blue is used for terms that have a relation with the terms in this document, but occur in other documents.
You can navigate and zoom the map. Mouse-hovering a term displays its timeline, clicking it yields the associated documents.

Author Collaborations