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Permanent URL to this publication: http://dx.doi.org/10.5167/uzh-49932

Nytko, K J. Regulated Function of Oxygen Sensing HIF Prolyl-4-Hydroxylases. 2011, University of Zurich, Faculty of Science.

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Abstract

Eine genaue Rezeption des zellulären Sauerstoffgehalts durch Prolyl-4-Hydroxylase Domänen (PHD) enthaltende Sauerstoff-Sensorproteine ist für viele physiologische
Prozesse im menschlichen Körper von grosser Bedeutung. Dieselben Signalwege spielen aber auch bei der Ausbildung von Krankheiten eine entscheidende Rolle. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) sind das vorrangige Hydroxylierungssubstrat für PHDs und fungieren als Sauerstoff-regulierte Transkriptionsfaktoren, indem sie
die Expression von mehr als 100 Zielgenen kontrollieren. Die wichtigsten Beispiele für HIF-regulierte Genprodukte sind unter anderem das für die Neubildung von Erythrozyten verantwortliche Erythropoietin (EPO), aber auch pro-angiogene Wachstumsfaktoren wie VEGF und Proteine des zellulären Glukose-Stoffwechsels (z.B. GLUT1, PDK1). Die enzymatische Aktivität von PHDs ist unmittelbar an die
Verfügbarkeit von Sauerstoff gekoppelt, aber auch andere Kofaktoren und Kosubstrate beeinflussen ihre spezifische Hydroxylierungskapazität. Die Nutzung eines Hydroxylierungsassays als rekonstituiertes System erlaubte uns, die Abhängigkeit aller drei PHD Isoformen von verschiedenen einfachen, potentiell inhibierenden oder aktivierenden Substanzen („small molecules“) zu untersuchen.
Während die enzymatische Aktivität von PHDs in Gegenwart von Eisen(II), 2-Oxoglutarat und Ascorbat dosisabhängig gesteigert war, inhibierten Substanzen wie Succinat oder polyphenolische Antioxidantien die Hydroxylierungs-aktivität der PHDs. Übergangsmetalle wie Kobalt(II) und Zink(II), chelierende Agenzien (DFX, EDTA) und reaktive Sauerstoffspezies (Wasserstoffperoxid) waren weitere effiziente Hemmstoffe der PHDs. Mechanistisch funktionieren diese Substanzen zumindest teilweise durch die Abreicherung oder Inaktivierung eines oder mehrerer der für die
Hydroxylierungs-reaktion notwendigen Kofaktoren. In diesem Zusammenhang konnten wir zeigen, dass Kupfer(II), jedoch nicht Kobalt(II) oder Eisen(II), die Oxidation von Ascorbat zu Dehydroascorbat katalysieren kann, wobei letzteres keinen
aktivierenden Einfluss mehr auf die PHDs ausübt. Eine Mangelversorgung mit Ascorbat (Vitamin C) verursacht die als Skorbut bekannte Systemerkrankung mit unzureichender Quervernetzung des Kollagens im Bindegewebe, der eine verminderte Aktivität der Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylasen zugrunde liegt. Da PHDs zur gleichen Untergruppe von Enzymen wie Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylasen gehören, wurde in dieser Arbeit ein möglicher Einfluss von Ascorbat auf Mechanismen der Sauerstoff-Rezeption in vivo untersucht.
Hierzu fand ein genetisch modifiziertes Tiermodell mit Mäusen Verwendung, die eine biallelische Inaktivierung des L-Gulonolacton Oxidasegens (Gulo) aufweisen, das für
ein Schlüsselenzym zur körpereigenen Synthese von Ascorbat kodiert. Folglich sind diese Tiere abhängig von der Aufnahme von Ascorbat mit der Nahrung. Im Vergleich zu Tieren, die Ascorbat mit dem Trinkwasser erhielten, zeigten Gulo-/- Mäuse, denen fünf Wochen lang eine Ascorbat-freie Diät gefüttert wurde, keine wesentlichen Änderungen in der Expression von HIF Zielgenen. Ausserdem konnten keine merklichen Unterschiede zwischen beiden Behandlungsgruppen in der Expression von EPO mRNA in der Niere und zirkulierendem EPO Protein im Plasma nach einer 24-stündigen hypoxischen Episode mit einer inspiratorischen Sauerstoffkonzentration von ca. 8% O2 festgestellt werden. Unsere Daten legen nahe, dass eine Ascorbat-Defizienz keinen Einfluss auf die systemische Adaptation an Sauerstoffmangelzustände hat und die Rolle von Ascorbat im Organismus durch andere Antioxidantien kompensiert werden kann. Diese Hypothese findet zusätzlich Unterstützung in der Beobachtung, dass humane Zervixkarzinom-Zellen, die unter vollständig Ascorbat-freien Kulturbedingungen gehalten wurden, eine identische hypoxische HIF-1α Stablilisierung und transkriptionelle HIF Aktivität zeigten wie Zellen, die in Gegenwart von 50 μM Ascorbat wuchsen. Glutathion (GSH) ist das weitaus verbreitetste Antioxidant in menschlichen Zellen, weswegen wir den Einfluss von GSH auf die enzymatische Aktivität von PHDs in vitro untersucht haben.
Tatsächlich wurden alle drei PHD Isoformen in dosisabhängiger Weise durch GSH aktiviert. Analog zur Behandlung mit Ascorbat zeigten humane Hepatomazellen in
Gegenwart von GSH einen reduzierten HIF-1α Proteingehalt, wie auch die transkriptionelle Aktivität von Kobalt(II)-induziertem HIF vermindert war. Desweiteren veringerte Glutathion die durch Fenton-Reaktion bzw. Kobalt(II)- und Wasserstoffperoxid-vermittelte Proteinoxidation von rekombinantem PHD2 Enzym, wie durch das Messen der Proteinkarbonylierung bestimmt wurde. Interessanterweise konnte die Mutation des Cysteinrestes an Position 201 des Proteins zu Serin die basale Hydroxylierungsaktivität von PHD2 erhöhen und steigerte die Resistenz des rekombinanten Proteins gegenüber oxidativen Noxen. Dieser strukturell zugängliche und konservierte Cysteinrest stellt daher einen möglichen Angriffspunkt zur
antioxidativen Aktivierung von PHDs durch Vitamin C und Glutathion dar.

Item Type:Dissertation
Referees:Wenger R H, Stiehl D P, Camenisch G, Grimm C, Oehme F
Communities & Collections:04 Faculty of Medicine > University Hospital Zurich > Ophthalmology Clinic
04 Faculty of Medicine > Institute of Physiology
07 Faculty of Science > Institute of Physiology

04 Faculty of Medicine > Center for Integrative Human Physiology
DDC:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Date:2011
Deposited On:18 Oct 2011 11:37
Last Modified:17 Oct 2012 03:31
Number of Pages:164
Related URLs:http://opac.nebis.ch/F/?local_base=NEBIS&con_lng=GER&func=find-b&find_code=SYS&request=006630744

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