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Funktionelle Charakterisierung neuer Interaktionen zwischen chlamydialen Proteinen und Wirtszellproteinen


Borth, N. Funktionelle Charakterisierung neuer Interaktionen zwischen chlamydialen Proteinen und Wirtszellproteinen. 2011, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Zusammenfassung
Chlamydien sind bakterielle, obligat intrazelluläre Parasiten, die sich durch einen zweiphasigen Entwicklungszyklus auszeichnen, welcher in einem vakuolären Einschlusskörper, genannt Inklusion, abläuft. Sie exprimieren Wirts-interagierende Proteine, sekretieren diese mithilfe der Typ-II- oder Typ-III Sekretionssysteme und können so direkt in zelluläre Prozesse des Wirtes
eingreifen. In Hefe-Zweihybrid-Screenings wurden verschiedene Effektoren von humanpathogenen und zoonotischen Chlamydien als Köderproteine eingesetzt. Unter Anderen wurde die Interaktion zwischen dem Typ-III-sekretierten, membranständigen Protein IncA aus Cp. psittaci und dem humanen G3BP1 identifiziert. Durch GST-Pulldown- und Ko-Immunopräzipitationsexperimente
konnte die Bindung der beiden Proteine in vitro und in vivo bestätigt werden. Mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie wurde die Anreicherung von G3BP1 um den Einschlusskörper in
Cp. psittaci-infizierten HEp-2-Zellen gezeigt. Sowohl die Infektion von HEp-2-Zellen mit Cp. psittaci als auch die Überexpression von IncA in HEK293-Zellen und der G3BP1-Knockdown mittels siRNA führten zu einer Abnahme der c-Myc-Proteinkonzentration. Die c-myc mRNA blieb jedoch unbeeinflusst, wie sich in Real-Time-PCR-Experimenten zeigte. Der Effekt der Abnahme von c-Myc könnte der Interaktion zwischen IncA und G3BP1 zugeschrieben werden, da die Überexpression eines mutierten IncA-Konstrukts, welches nicht mehr mit G3BP1 interagiert, keinen Einfluss auf die c-Myc-Konzentration hatte. Trotz sehr geringer Sequenzhomologie war auch mit IncA aus C. trachomatis die Interaktion mit G3BP1 in S. cerevisiae und in vitro
nachweisbar. Es wird diskutiert über welche zellulären Mechanismen die Abnahme des c-Myc-Proteins vermittelt werden könnte und welche Folgen daraus sowohl für die Chlamydien als auch für die Wirtszelle resultieren. Ein weiteres Köderprotein, das im Hefe-Zweihybrid-System
verwendet wurde, war die PDZ-Domäne der chlamydialen, Typ-II-sekretierten Protease CT441 aus C. trachomatis. Neben einigen anderen Wirtsproteinen konnte das humane Steroidrezeptor-Ko-Aktivator Protein SRAP1 als Interaktionspartner identifiziert werden. Dieser Modulator der Estrogenrezeptor-Aktivität ist als RNA sowie als Protein funktionell. Die Interaktion zwischen CT441 und SRAP1 wurde in S. cerevisiae und in vitro nachgewiesen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die PDZ-Domäne SRAP1 in zelluläre Kompartimente dirigieren kann und in S. cerevisiae die Estrogenrezeptor-Aktivierung partiell vermindert. SRAP1 wird nicht durch CT441 gespalten,
sondern im Zytoplasma zurückgehalten. Dadurch wird auch im eukaryotischen Zellsystem die durch SRAP1 vermittelte Ko-Aktivierung des Estrogenrezeptors α von CT441 herabgesetzt. Mögliche Auswirkungen der spezifischen Bindung des Proteins SRAP1 durch CT441 bzw. durch die PDZ-Domäne auf die Regulation des Wirtszell-Metabolismus werden diskutiert.

Abstract
Chlamydiaceae are obligate intracellular pathogens which proliferate in a vacuolar compartment termed inclusion. They are distinguished by a unique biphasic developmental cycle. Through type II and type III secretion systems, Chlamydiae secrete host-interactive proteins capable of directly modulating eukaryotic pathways. For Yeast Two-Hybrid screenings different, effectors of human
pathogen and zoonotic Chlamydiae were used as baits. Among others, the interaction between the type III secreted membrane bound protein IncA of Cp. psittaci and human G3BP1 could be observed. In GST-pulldown and co-immunoprecipitation experiments, both in vitro and in vivo interactions were shown. Using fluorescence microscopy, the localization of G3BP1 near the inclusion membrane of Cp. psittaci-infected HEp-2-cells was demonstrated. The infection of HEp-2-cells with Cp. psittaci as well as the overexpression of IncA in HEK293-cells and the knockdown of G3BP1 using siRNA led to a decrease in c-Myc protein concentration. The effect of decreasing c-Myc-concentration could be ascribed to the interaction between IncA and G3BP1, since overexpression of an IncA mutant construct, which was not able to interact with G3BP1, failed to reduce c-Myc protein concentration. c-myc mRNA remained unaffected as was shown in real-time
PCR experiments. Despite very low sequence homology IncA of C. trachomatis was also able to interact with G3BP1 in S. cerevisiae and in vitro. The cellular mechanisms underlying the decrease of c-Myc protein concentration and the consequences for both chlamydia and for the host cell are
discussed. Another bait used in Yeast Two-Hybrid screenings was the PDZ domain of chlamydial type II secreted protease CT441 of C. trachomatis. In addition to some more interacting host proteins, human steroid receptor co-activator protein SRAP1 was identified. SRAP1 is a modulator of estrogen receptor α (ERα) activity and is able to function both as RNA and as a protein. The
interaction between CT441 and SRAP1 was demonstrated in S. cerevisiae and in vitro. Additionally, it was shown that the PDZ domain of CT441 was able to bind and target SRAP1 in cellular compartments. In heterologous yeast system, the ERα co-activation of SRAP1 was partially alleviated by the PDZ domain. SRAP1 is not cleaved by CT441 but it is retained in the cytoplasm and thereby, the SRAP1 mediated co-activation of ERα was also diminished in mammalian cells. Possible implications of chlamydial regulation of host metabolism by targeting ERα activity through specific binding of SRAP1 to CT441 or PDZ domain are discussed.

Abstract

Zusammenfassung
Chlamydien sind bakterielle, obligat intrazelluläre Parasiten, die sich durch einen zweiphasigen Entwicklungszyklus auszeichnen, welcher in einem vakuolären Einschlusskörper, genannt Inklusion, abläuft. Sie exprimieren Wirts-interagierende Proteine, sekretieren diese mithilfe der Typ-II- oder Typ-III Sekretionssysteme und können so direkt in zelluläre Prozesse des Wirtes
eingreifen. In Hefe-Zweihybrid-Screenings wurden verschiedene Effektoren von humanpathogenen und zoonotischen Chlamydien als Köderproteine eingesetzt. Unter Anderen wurde die Interaktion zwischen dem Typ-III-sekretierten, membranständigen Protein IncA aus Cp. psittaci und dem humanen G3BP1 identifiziert. Durch GST-Pulldown- und Ko-Immunopräzipitationsexperimente
konnte die Bindung der beiden Proteine in vitro und in vivo bestätigt werden. Mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie wurde die Anreicherung von G3BP1 um den Einschlusskörper in
Cp. psittaci-infizierten HEp-2-Zellen gezeigt. Sowohl die Infektion von HEp-2-Zellen mit Cp. psittaci als auch die Überexpression von IncA in HEK293-Zellen und der G3BP1-Knockdown mittels siRNA führten zu einer Abnahme der c-Myc-Proteinkonzentration. Die c-myc mRNA blieb jedoch unbeeinflusst, wie sich in Real-Time-PCR-Experimenten zeigte. Der Effekt der Abnahme von c-Myc könnte der Interaktion zwischen IncA und G3BP1 zugeschrieben werden, da die Überexpression eines mutierten IncA-Konstrukts, welches nicht mehr mit G3BP1 interagiert, keinen Einfluss auf die c-Myc-Konzentration hatte. Trotz sehr geringer Sequenzhomologie war auch mit IncA aus C. trachomatis die Interaktion mit G3BP1 in S. cerevisiae und in vitro
nachweisbar. Es wird diskutiert über welche zellulären Mechanismen die Abnahme des c-Myc-Proteins vermittelt werden könnte und welche Folgen daraus sowohl für die Chlamydien als auch für die Wirtszelle resultieren. Ein weiteres Köderprotein, das im Hefe-Zweihybrid-System
verwendet wurde, war die PDZ-Domäne der chlamydialen, Typ-II-sekretierten Protease CT441 aus C. trachomatis. Neben einigen anderen Wirtsproteinen konnte das humane Steroidrezeptor-Ko-Aktivator Protein SRAP1 als Interaktionspartner identifiziert werden. Dieser Modulator der Estrogenrezeptor-Aktivität ist als RNA sowie als Protein funktionell. Die Interaktion zwischen CT441 und SRAP1 wurde in S. cerevisiae und in vitro nachgewiesen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die PDZ-Domäne SRAP1 in zelluläre Kompartimente dirigieren kann und in S. cerevisiae die Estrogenrezeptor-Aktivierung partiell vermindert. SRAP1 wird nicht durch CT441 gespalten,
sondern im Zytoplasma zurückgehalten. Dadurch wird auch im eukaryotischen Zellsystem die durch SRAP1 vermittelte Ko-Aktivierung des Estrogenrezeptors α von CT441 herabgesetzt. Mögliche Auswirkungen der spezifischen Bindung des Proteins SRAP1 durch CT441 bzw. durch die PDZ-Domäne auf die Regulation des Wirtszell-Metabolismus werden diskutiert.

Abstract
Chlamydiaceae are obligate intracellular pathogens which proliferate in a vacuolar compartment termed inclusion. They are distinguished by a unique biphasic developmental cycle. Through type II and type III secretion systems, Chlamydiae secrete host-interactive proteins capable of directly modulating eukaryotic pathways. For Yeast Two-Hybrid screenings different, effectors of human
pathogen and zoonotic Chlamydiae were used as baits. Among others, the interaction between the type III secreted membrane bound protein IncA of Cp. psittaci and human G3BP1 could be observed. In GST-pulldown and co-immunoprecipitation experiments, both in vitro and in vivo interactions were shown. Using fluorescence microscopy, the localization of G3BP1 near the inclusion membrane of Cp. psittaci-infected HEp-2-cells was demonstrated. The infection of HEp-2-cells with Cp. psittaci as well as the overexpression of IncA in HEK293-cells and the knockdown of G3BP1 using siRNA led to a decrease in c-Myc protein concentration. The effect of decreasing c-Myc-concentration could be ascribed to the interaction between IncA and G3BP1, since overexpression of an IncA mutant construct, which was not able to interact with G3BP1, failed to reduce c-Myc protein concentration. c-myc mRNA remained unaffected as was shown in real-time
PCR experiments. Despite very low sequence homology IncA of C. trachomatis was also able to interact with G3BP1 in S. cerevisiae and in vitro. The cellular mechanisms underlying the decrease of c-Myc protein concentration and the consequences for both chlamydia and for the host cell are
discussed. Another bait used in Yeast Two-Hybrid screenings was the PDZ domain of chlamydial type II secreted protease CT441 of C. trachomatis. In addition to some more interacting host proteins, human steroid receptor co-activator protein SRAP1 was identified. SRAP1 is a modulator of estrogen receptor α (ERα) activity and is able to function both as RNA and as a protein. The
interaction between CT441 and SRAP1 was demonstrated in S. cerevisiae and in vitro. Additionally, it was shown that the PDZ domain of CT441 was able to bind and target SRAP1 in cellular compartments. In heterologous yeast system, the ERα co-activation of SRAP1 was partially alleviated by the PDZ domain. SRAP1 is not cleaved by CT441 but it is retained in the cytoplasm and thereby, the SRAP1 mediated co-activation of ERα was also diminished in mammalian cells. Possible implications of chlamydial regulation of host metabolism by targeting ERα activity through specific binding of SRAP1 to CT441 or PDZ domain are discussed.

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Item Type:Dissertation
Referees:Saluz H P, Pospischil A
Communities & Collections:05 Vetsuisse Faculty > Institute of Veterinary Pathology
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:German
Date:2011
Deposited On:12 May 2011 12:55
Last Modified:12 Aug 2017 10:15

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