Header

UZH-Logo

Maintenance Infos

Functional characterization of the interaction of PHD2 with FKBP38


Barth, Sandra. Functional characterization of the interaction of PHD2 with FKBP38. 2008, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG

Summary

Multicellular complex organisms utilize oxygen as the final electron acceptor in the cellular aerobic glucose catabolism and β-oxidation of fatty acids to efficiently generate ATP. Hence, oxygen deprivation (hypoxia) requires adaptive mechanisms to respond to this stress stimulus. Response to hypoxia is governed by the transcription factor hypoxia-inducible factor (HIF) that regulates the expression of at least 70 known target genes that allow the organism to adapt on the cellular, local and systemic level. HIF is a heterodimeric protein complex that consists of an oxygen-dependently regulated HIF-α subunit and a constitutively expressed HIF-β subunit. The HIF-α subunit protein stability is tightly regulated by hydroxylation of specific prolines in the oxygen-dependent degradation domain (ODDD) by prolyl-4- hydroxylases (PHDs) that require oxygen as a substrate for their enzymatic reaction. Hydroxylated HIF-α is targeted by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein (pVHL), the recognition component of an E3 ubiquitin ligase complex, and subsequently degraded in the 26S proteasome. Besides HIF-α, only a few other PHD hydroxylation targets have been described so far. We investigated the possibility of further hydroxylation targets for the PHD2 isoform and if other regulatory mechanisms apart from molecular oxygen might be important in the PHD2 protein regulation. A yeast two-hybrid screening was carried out to identify novel PHD2 interacting partners. Among the identified interactors, we found the FK506-binding protein 38 (FKBP38). The specific interaction of FKBP38 with PHD2 but not PHD1 or PHD3 was confirmed in a variety of interaction assays, including yeast and mammalian two- hybrid analysis, GST pull-down and co-immunoprecipitation experiments and fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis. FKBP38 was shown to bind with a linear minimal glutamate rich binding motif from amino acid (aa) 37 to 56 to PHD2. Conversely, PHD2 interacts with its N-terminal region from aa 1 to 114, containing a MYND-type Zn2+ finger domain, with FKBP38. Originally FKBP38 was identified as a target of the immunosuppressive drug FK506 and it has been proposed that FKBP38 regulates cell death or survival. FKBP38 belongs to the family of peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIases) that participate in the conformational change of the aa proline from the cis to the trans position, providing the basis for a potential regulatory switch. Thus, we speculated that

-1- SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG

FKBP38 might be a co-factor that is involved in the PHD-mediated enzymatic proline hydroxylation of HIF-α subunits. Stable RNA interference (RNAi)-mediated downregulation of FKBP38 increased PHD2 protein abundance and cellular hydroxylation activity. Conversely, elevated PHD2 protein levels decreased hypoxic HIF-1α protein accumulation and attenuated HIF-dependent transcriptional regulation. Reconstitution of FKBP38 normalized PHD2 protein levels and therefore cellular hydroxylation capacity and HIF-1 response. Strikingly, increased PHD2 protein abundance was due to prolonged PHD2 protein stability, suggesting that FKBP38 determines PHD2 protein levels. However, we did not find any involvement of the FKBP38 enzymatic PPIase activity in the regulation of PHD2 protein abundance. So far, little is known about PHD2 protein regulation and we therefore further explored the molecular mechanism of FKBP38-dependent PHD2 protein regulation. PHD2 protein stability was neither influenced by a variety of protease inhibitors nor by inhibition of the ubiquitin- dependent proteasomal degradation pathway. Interestingly, in cellular assays the C- terminal transmembrane domain of FKBP38 is required for a specific interaction with PHD2 in spite of the existence of a functional FKBP38 interaction domain at the N- terminus. Consistent with these data, we could co-isolate FKBP38 and PHD2 from endoplasmatic reticulum and mitochondria membranes. Strikingly, regulation of PHD2 protein abundance requires the correct sub-cellular localization of FKBP38. As an outlook, targeting FKBP38:PHD2 protein interaction by chemical compounds might be an attractive strategy to specifically increase PHD2 amount and therefore attenuate HIF protein levels in tumors.



-2- SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG

3 Multizelluläre komplexe Organismen benötigen Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor im zellulären Glukoseabbau und bei der β-Oxidation von Fettsäuren, um effizient ATP zu produzieren. Deshalb werden bei Sauerstoffmangel (Hypoxie) Anpassungsmechanismen benötigt, um auf diesen Stressstimulus adäquat zu antworten. Die Antwort auf Hypoxie wird durch den Transkriptionsfaktor Hypoxie- induzierbarer Faktor (HIF) gesteuert, der die Expression von mehr als 70 bekannten Zielgenen reguliert, die es dem Organismus ermöglichen, sich auf zellulärer, lokaler und systemischer Ebene anzupassen. HIF ist ein heterodimerer Proteinkomplex, der aus einer HIF-α Untereinheit besteht, die sauerstoffabhängig reguliert wird und aus einer konstitutiv exprimierten HIF-β Untereinheit. Die Proteinstabilität der HIF-α Untereinheit wird streng reguliert durch die Hydroxylierung von spezifischen Prolinen in der sauerstoffabhängigen Destabilisierungsdomäne (ODDD) durch Prolyl-4- Hydroxylasen, die molekularen Sauerstoff als Substrat für die enzymatische Reaktion essentiell benötigen. Hydroxyliertes HIF-α wird an das von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Protein (pVHL) gebunden, das die Erkennungseinheit eines E3 Ubiquitin- Ligase Komplexes darstellt, und anschließend im 26S Proteasom abgebaut. Außer HIF-α sind gegenwärtig nur wenig andere Hydroxylierungssubstrate der PHDs bekannt. Wir untersuchten die Möglichkeit, ob weitere Hydroxylierungssubstrate für die PHD2 Isoform existieren und ob es neben Sauerstoff noch andere regulatorische Mechanismen gibt, die PHD2 regulieren. Ein Zwei-Hybrid Screening in der Hefe wurde durchgeführt, um neue PHD2 interagierende Partner zu identifizieren. Unter den neu entdeckten Interaktoren fanden wir das FK506-bindende Protein 38 (FKBP38). Die spezifische Interaktion von FKBP38 mit PHD2 bestätigten wir in einer Vielzahl von Interaktionsstudien wie Hefe und Säugetier Zwei-Hybrid Interaktionsanalysen, in GST pull-down- und Co- Immunopräzipitationsexperimenten und in der Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Analyse. FKBP38 bindet an ein lineares glutamatreiches minimales Bindungsmotiv von Aminosäure 37 bis 56 in PHD2. Umgekehrt interagiert PHD2 mit seiner N-terminalen Region von Aminosäure 1 bis 114 in FKBP38, die eine MYND ähnliche Zn2+ Fingerdomäne enthält. FKBP38 entdeckte man ursprünglich als eine Zielstruktur für den immunsuppressiven Wirkstoff FK506 und es wird angenommen, dass FKBP38 den Zelltod oder das Überleben von Zellen reguliert. FKBP38 gehört zur Familie der Peptidylprolyl- -3- SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG

cis/trans-Isomerasen (PPIase), die die Konformationsänderung der Aminosäure Prolin von der cis in die trans Position steuern und kann die Basis für eine regulatorische Veränderung bilden. Deshalb spekulierten wir, dass FKBP38 womöglich als Kofaktor fungiert, um die PHD gesteuerte enzymatische Prolinhydroxylierung der HIF-α Untereinheit zu regulieren. Jedoch erhöhte sich die PHD2 Proteinmenge und die zelluläre Hydroxylierungsaktivität durch die stabile Herunterregulation von FKBP38 durch RNA Interferenz (RNAi). Durch die erhöhte PHD2 Proteinmenge akkumulierte HIF-1α Protein in der Hypoxie weniger und die HIF-abhängige transkriptionelle Aktivität war abgeschwächt. Überraschenderweise war die Zunahme der PHD2 Proteinmenge aufgrund einer verlängerten PHD2 Proteinstabilität und deshalb schlagen wir vor, das FKBP38 die PHD2 Proteinmenge reguliert. Wir konnten bisher keine Beteiligung der FKBP38 PPIase Aktivitätsdomäne als Regulator der PHD2 Proteinmenge feststellen. Bisher ist sehr wenig über die PHD2 Proteinregulation bekannt und deshalb untersuchten wir den molekularen Mechanismus der FKBP38-abhängigen PHD2 Proteinregulierung. Die PHD2 Stabilität war weder durch eine Vielzahl von Proteaseninhibitoren beeinflusst noch durch die Blockierung des Ubiquitin-Proteasom Degradationssignalweges. Interessanterweise wird die C-terminale Transmembrandomäne von FKBP38 in zellulären Experimenten für die spezifische Interaktion mit PHD2 benötigt, obwohl die funktionsfähige Interaktionsdomäne am N- Terminus noch vorhanden ist. Konsistent mit diesen Daten konnten wir FKBP38 und PHD2 in endoplasmatischen und Mitochondrienmembranen isolieren und detektieren. Überraschenderweise benötigte die Regulation der PHD2 Menge die korrekte subzelluläre Lokalisation von FKBP38. Die Aufhebung der FKBP38:PHD2 Interaktion durch chemische Wirkstoffe könnte eine interessante Zielstruktur sein, um spezifisch durch die Zunahme von PHD2 die HIF Proteinmenge in Tumoren zu reduzieren.



-4-

Abstract

SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG

Summary

Multicellular complex organisms utilize oxygen as the final electron acceptor in the cellular aerobic glucose catabolism and β-oxidation of fatty acids to efficiently generate ATP. Hence, oxygen deprivation (hypoxia) requires adaptive mechanisms to respond to this stress stimulus. Response to hypoxia is governed by the transcription factor hypoxia-inducible factor (HIF) that regulates the expression of at least 70 known target genes that allow the organism to adapt on the cellular, local and systemic level. HIF is a heterodimeric protein complex that consists of an oxygen-dependently regulated HIF-α subunit and a constitutively expressed HIF-β subunit. The HIF-α subunit protein stability is tightly regulated by hydroxylation of specific prolines in the oxygen-dependent degradation domain (ODDD) by prolyl-4- hydroxylases (PHDs) that require oxygen as a substrate for their enzymatic reaction. Hydroxylated HIF-α is targeted by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein (pVHL), the recognition component of an E3 ubiquitin ligase complex, and subsequently degraded in the 26S proteasome. Besides HIF-α, only a few other PHD hydroxylation targets have been described so far. We investigated the possibility of further hydroxylation targets for the PHD2 isoform and if other regulatory mechanisms apart from molecular oxygen might be important in the PHD2 protein regulation. A yeast two-hybrid screening was carried out to identify novel PHD2 interacting partners. Among the identified interactors, we found the FK506-binding protein 38 (FKBP38). The specific interaction of FKBP38 with PHD2 but not PHD1 or PHD3 was confirmed in a variety of interaction assays, including yeast and mammalian two- hybrid analysis, GST pull-down and co-immunoprecipitation experiments and fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis. FKBP38 was shown to bind with a linear minimal glutamate rich binding motif from amino acid (aa) 37 to 56 to PHD2. Conversely, PHD2 interacts with its N-terminal region from aa 1 to 114, containing a MYND-type Zn2+ finger domain, with FKBP38. Originally FKBP38 was identified as a target of the immunosuppressive drug FK506 and it has been proposed that FKBP38 regulates cell death or survival. FKBP38 belongs to the family of peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIases) that participate in the conformational change of the aa proline from the cis to the trans position, providing the basis for a potential regulatory switch. Thus, we speculated that

-1- SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG

FKBP38 might be a co-factor that is involved in the PHD-mediated enzymatic proline hydroxylation of HIF-α subunits. Stable RNA interference (RNAi)-mediated downregulation of FKBP38 increased PHD2 protein abundance and cellular hydroxylation activity. Conversely, elevated PHD2 protein levels decreased hypoxic HIF-1α protein accumulation and attenuated HIF-dependent transcriptional regulation. Reconstitution of FKBP38 normalized PHD2 protein levels and therefore cellular hydroxylation capacity and HIF-1 response. Strikingly, increased PHD2 protein abundance was due to prolonged PHD2 protein stability, suggesting that FKBP38 determines PHD2 protein levels. However, we did not find any involvement of the FKBP38 enzymatic PPIase activity in the regulation of PHD2 protein abundance. So far, little is known about PHD2 protein regulation and we therefore further explored the molecular mechanism of FKBP38-dependent PHD2 protein regulation. PHD2 protein stability was neither influenced by a variety of protease inhibitors nor by inhibition of the ubiquitin- dependent proteasomal degradation pathway. Interestingly, in cellular assays the C- terminal transmembrane domain of FKBP38 is required for a specific interaction with PHD2 in spite of the existence of a functional FKBP38 interaction domain at the N- terminus. Consistent with these data, we could co-isolate FKBP38 and PHD2 from endoplasmatic reticulum and mitochondria membranes. Strikingly, regulation of PHD2 protein abundance requires the correct sub-cellular localization of FKBP38. As an outlook, targeting FKBP38:PHD2 protein interaction by chemical compounds might be an attractive strategy to specifically increase PHD2 amount and therefore attenuate HIF protein levels in tumors.



-2- SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG

3 Multizelluläre komplexe Organismen benötigen Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor im zellulären Glukoseabbau und bei der β-Oxidation von Fettsäuren, um effizient ATP zu produzieren. Deshalb werden bei Sauerstoffmangel (Hypoxie) Anpassungsmechanismen benötigt, um auf diesen Stressstimulus adäquat zu antworten. Die Antwort auf Hypoxie wird durch den Transkriptionsfaktor Hypoxie- induzierbarer Faktor (HIF) gesteuert, der die Expression von mehr als 70 bekannten Zielgenen reguliert, die es dem Organismus ermöglichen, sich auf zellulärer, lokaler und systemischer Ebene anzupassen. HIF ist ein heterodimerer Proteinkomplex, der aus einer HIF-α Untereinheit besteht, die sauerstoffabhängig reguliert wird und aus einer konstitutiv exprimierten HIF-β Untereinheit. Die Proteinstabilität der HIF-α Untereinheit wird streng reguliert durch die Hydroxylierung von spezifischen Prolinen in der sauerstoffabhängigen Destabilisierungsdomäne (ODDD) durch Prolyl-4- Hydroxylasen, die molekularen Sauerstoff als Substrat für die enzymatische Reaktion essentiell benötigen. Hydroxyliertes HIF-α wird an das von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Protein (pVHL) gebunden, das die Erkennungseinheit eines E3 Ubiquitin- Ligase Komplexes darstellt, und anschließend im 26S Proteasom abgebaut. Außer HIF-α sind gegenwärtig nur wenig andere Hydroxylierungssubstrate der PHDs bekannt. Wir untersuchten die Möglichkeit, ob weitere Hydroxylierungssubstrate für die PHD2 Isoform existieren und ob es neben Sauerstoff noch andere regulatorische Mechanismen gibt, die PHD2 regulieren. Ein Zwei-Hybrid Screening in der Hefe wurde durchgeführt, um neue PHD2 interagierende Partner zu identifizieren. Unter den neu entdeckten Interaktoren fanden wir das FK506-bindende Protein 38 (FKBP38). Die spezifische Interaktion von FKBP38 mit PHD2 bestätigten wir in einer Vielzahl von Interaktionsstudien wie Hefe und Säugetier Zwei-Hybrid Interaktionsanalysen, in GST pull-down- und Co- Immunopräzipitationsexperimenten und in der Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Analyse. FKBP38 bindet an ein lineares glutamatreiches minimales Bindungsmotiv von Aminosäure 37 bis 56 in PHD2. Umgekehrt interagiert PHD2 mit seiner N-terminalen Region von Aminosäure 1 bis 114 in FKBP38, die eine MYND ähnliche Zn2+ Fingerdomäne enthält. FKBP38 entdeckte man ursprünglich als eine Zielstruktur für den immunsuppressiven Wirkstoff FK506 und es wird angenommen, dass FKBP38 den Zelltod oder das Überleben von Zellen reguliert. FKBP38 gehört zur Familie der Peptidylprolyl- -3- SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG

cis/trans-Isomerasen (PPIase), die die Konformationsänderung der Aminosäure Prolin von der cis in die trans Position steuern und kann die Basis für eine regulatorische Veränderung bilden. Deshalb spekulierten wir, dass FKBP38 womöglich als Kofaktor fungiert, um die PHD gesteuerte enzymatische Prolinhydroxylierung der HIF-α Untereinheit zu regulieren. Jedoch erhöhte sich die PHD2 Proteinmenge und die zelluläre Hydroxylierungsaktivität durch die stabile Herunterregulation von FKBP38 durch RNA Interferenz (RNAi). Durch die erhöhte PHD2 Proteinmenge akkumulierte HIF-1α Protein in der Hypoxie weniger und die HIF-abhängige transkriptionelle Aktivität war abgeschwächt. Überraschenderweise war die Zunahme der PHD2 Proteinmenge aufgrund einer verlängerten PHD2 Proteinstabilität und deshalb schlagen wir vor, das FKBP38 die PHD2 Proteinmenge reguliert. Wir konnten bisher keine Beteiligung der FKBP38 PPIase Aktivitätsdomäne als Regulator der PHD2 Proteinmenge feststellen. Bisher ist sehr wenig über die PHD2 Proteinregulation bekannt und deshalb untersuchten wir den molekularen Mechanismus der FKBP38-abhängigen PHD2 Proteinregulierung. Die PHD2 Stabilität war weder durch eine Vielzahl von Proteaseninhibitoren beeinflusst noch durch die Blockierung des Ubiquitin-Proteasom Degradationssignalweges. Interessanterweise wird die C-terminale Transmembrandomäne von FKBP38 in zellulären Experimenten für die spezifische Interaktion mit PHD2 benötigt, obwohl die funktionsfähige Interaktionsdomäne am N- Terminus noch vorhanden ist. Konsistent mit diesen Daten konnten wir FKBP38 und PHD2 in endoplasmatischen und Mitochondrienmembranen isolieren und detektieren. Überraschenderweise benötigte die Regulation der PHD2 Menge die korrekte subzelluläre Lokalisation von FKBP38. Die Aufhebung der FKBP38:PHD2 Interaktion durch chemische Wirkstoffe könnte eine interessante Zielstruktur sein, um spezifisch durch die Zunahme von PHD2 die HIF Proteinmenge in Tumoren zu reduzieren.



-4-

Statistics

Downloads

1382 downloads since deposited on 19 Jan 2009
112 downloads since 12 months
Detailed statistics

Additional indexing

Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Wenger Roland H
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2008
Deposited On:19 Jan 2009 08:23
Last Modified:24 Sep 2019 15:48
Number of Pages:96
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005707793&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

Download

Green Open Access

Download PDF  'Functional characterization of the interaction of PHD2 with FKBP38'.
Preview
Filetype: PDF
Size: 5MB