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Prion replication, phagocytosis, and the function of follicular dendritic cells


Kranich, Jan. Prion replication, phagocytosis, and the function of follicular dendritic cells. 2008, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary _____________________________________________________________________________________________________



2 Summary Follicular dendritic cells (FDCs) constitute an important cell type in the germinal center (GC) reaction. They are thought to supply GC B-cells with essential survival signals, drive affinity maturation and control generation and maintenance of memory B-cells. The exact molecular mechanisms of these processes are not well defined and despite their central role in the GC reaction, FDCs are probably one of the most poorly understood cell types of the immune system. Apart from their beneficial role in adaptive immunity FDCs also exert a noxious role in certain pathologies. It is well established that FDCs trap large amounts of HIV virions and thereby contribute to the pathogenesis of AIDS. Furthermore, FDCs also participate in prion diseases by replication and accumulation of disease-associated PrPSc in lymphoid organs. To gain deeper insights into FDC-biology by identifying FDC-specific genes and also to identify important factors necessary for prion replication by FDCs, an unbiased transcriptomic screen has been conducted. One interesting candidate found was the phosphatidylserine (PS)-binding protein Mfge8 (Huber et al., 2005), which was further investigated here. The observation that FDCs of Mfge8-/- mice lacked FDC-M1 expression, one of the most specific markers used to define FDCs, but of unknown identity, led to the discovery that FDC-M1 and Mfge8 are identical. This discovery will enable new methods to study and characterize FDCs. The role of Mfge8 in the removal of apoptotic cells is well established. It binds to PS on the surface of apoptotic cells, which is then recognized by integrins expressed on macrophages. This interaction induces the internalization of the apoptotic cell. Consequently, tingible-body macrophages (TBMφs) of Mfge8-/- mice exhibit a phagocytosis defect leading to impaired removal of apoptotic B-cells from the GC. This was reported to result in systemic lupus erythematosus (SLE) an autoimmune disease with autoantibodies directed against nuclear proteins. However, this report claimed that Mfge8 was produced by TBMφs and not by FDCs (Hanayama et al., 2004). I confute this view in my thesis by a detailed analysis of splenic Mfge8 expression by using reciprocal bone marrow (BM) chimeras between wild-type (WT) and Mfge8-/-

4 Summary _____________________________________________________________________________________________________

mice. In these mice Mfge8 expression was restricted to radioresistant FDCs. Radiosensitive TBMφs failed to show any detectable Mfge8 RNA expression. However, Mfge8 protein was easily detectable in TBMφs when FDCs expressed Mfge8 or when recombinant Mfge8 was injected subcutaneously. The absence of FDC-produced Mfge8 in wild-type Mfge8-/- bone-marrow chimeras resulted in impaired engulfment of apoptotic cells in the GC. The results I present here have led to a novel model of apoptotic cell removal in the GC, in which FDCs produce Mfge8 and opsonize apoptotic cells to target them for removal by TBMφs. Cell death occurs frequently in the GC, but TBMφ-numbers are low, which might be limiting for apoptotic corpse removal. Thus, by supplying TBMφs with detailed topological information where to engulf apoptotic cells FDCs guarantee a rapid and efficient removal of dying cells. Therefore, FDCs may play an active role in the prevention of autoimmunity by ensuring the rapid clearance of cell corpses from the GC. The question whether Mfge8 also contributes to prion pathogenesis was also addressed here. Mfge8 produced by FDCs seemed to have no influence on prion replication and accumulation in lymphoid organs. In contrast to this, Mfge8-/- mice showed a drastically accelerated prion pathogenesis after intracerebral inoculation, where disease progression is independent of prion replication in lymphoid organs. This acceleration was associated with elevated levels of PrPSc in the brain and decreased numbers of activated microglia in the cerebellum. These results indicate that Mfge8 might be involved in microglial-dependent degradation of prions.



5 Zusammenfassung _____________________________________________________________________________________________________



3 Zusammenfassung Follikuläre dendritische Zellen (FDCs) stellen einen wichtigen Zelltyp in der Keimzentrumsreaktion dar. Man nimmt an, dass sie dort B-Zellen mit wichtigen Überlebenssignalen versorgen, die Affinitätsreifung von B-Zellen kontrollieren, sowie die Entstehung und Erhaltung von B-Gedächtniszellen regulieren. Die genauen molekularen Mechanismen dieser Prozesse sind nicht hinreichend bekannt, und trotz ihrer wichtigen Rolle in der Keimzentrumsreaktion, sind FDCs einer der wohl am wenigsten verstandenen Zelltypen des Immunsystems. Ausser ihrer nützlichen Rolle in der adaptiven Immunabwehr, spielen FDCs auch eine schädliche Rolle in bestimmten Krankheiten. Es ist bekannt, dass FDCs grosse Mengen an HIV-Virionen binden und dadurch zur AIDS-Pathogenese beitragen. Desweiteren sind FDCs auch an Prionenerkrankungen beteiligt, indem sie das pathologische PrP-Konformer PrPSc in lymphatischen Organen vermehren und anreichern. Um ein genaueres Verständnis der FDC-Biologie durch die Identifikation FDC- spezifischer Gene zu bekommen und um wichtige Faktoren für die Prionen- replikation zu identifizieren, wurde eine unvoreingenommene Analyse des FDC- Transkriptoms durchgeführt. Ein interessanter Kandidat, der dabei gefunden wurde, war das Phosphatidlyserin (PS)-bindende Protein Mfge8 (Huber et al., 2005), was ich in dieser Arbeit genauer untersucht habe. Meine Beobachtung, dass FDCs von Mfge8-/- Mäusen kein FDC-M1 produzieren, das einen der spezifischsten FDC-Markern darstellt, aber dessen Identität bis dahin unbekannt war, hat zur Identifikation von FDC-M1 als Mfge8 geführt. Diese Entdeckung wird neue Methoden der Erforschung von FDCs ermöglichen. Es ist bekannt, dass Mfge8 an der Beseitigung von apoptotischen Zellen beteiligt ist, indem es an PS an der Oberfläche von apoptotischen Zellen bindet. Anschliessend wird dieser Komplex über Integrine, die von Makrophagen exprimiert werden erkannt, was die Internalisierung der apoptotischen Zellen durch Makrophagen induziert. Folglich zeigen Tingible-Body Makrophagen (TBMφs) von Mfge8-/- Mäusen einen Phagozytose-Defekt, was eine gestörte Beseitigung von apoptotischen Zellen zur Folge hat und schliesslich zu systemischen Lupus Erythematodes (SLE) führt, einer Autoimmunerkrankung, bei der Autoantikörper gegen nukleare Proteine gebildet



6 Zusammenfassung _____________________________________________________________________________________________________

werden. In jener Studie wurde allerdings berichtet, dass Mfge8 von TBMφs und nicht von FDCs produziert wird (Hanayama et al., 2004). Diese Ansicht konnte ich hier durch eine detaillierte Analyse der Mfge8-Expression in der Milz von Knochenmarkschimären zwischen Wildtyp und Mfge8-/- Mäusen widerlegen. Mfge8-Expression konnte in diesen Chimären nur in strahlungs- resistenten FDCs gefunden werden aber nicht in strahlungssensitiven TBMφs. Das Mfge8-Protein war allerdings in TBMφs präsent, wenn FDCs Mfge8 exprimierten oder wenn rekombinantes Mfge8 subkutan injiziert wurde. Die Abwesenheit von FDC- produziertem Mfge8 in Wildtyp Mfge8-/- Knochenmarkschimären beeinträchtigte die Beseitigung apoptotischer Zellen im Keimzentrum. Diese Entdeckung führte zu einer neuen Hypothese zur Beseitigung apoptotischer Zellen im Keimzentrum. Diese Hypothese besagt, dass Mfge8, das von FDCs produziert wird, apoptotische Zellen opsonisiert um sie für die Beseitigung durch TBMφs zu markieren. Im Keimzentrum ist Apoptose häufig, die Zahl der TBMφs aber gering, was auf die Beseitigung apoptotischer Zellen limitierend wirken könnte. Um trotzdem eine effiziente und schnelle Beseitigung der apoptotischen Zellen zu gewährleisten, teilen FDCs den TBMφs genaue topologische Informationen zur Lage von apoptotische Zellen mit, indem sie Mfge8 produzieren. FDCs stellen somit die schnelle Beseitigung apoptotischer Zellen im Keimzentrum sicher und verhindern dadurch vermutlich die Entstehung von Autoimmunerkrankungen. Auch die Frage, ob Mfge8 zur Prionen-Pathogenese beiträgt habe ich hier untersucht. Dabei wurden keine Hinweise darauf gefunden, dass FDC-produziertes Mfge8 die Prionenreplikation oder -anreicherung in lymphatischen Organen beeinflusst. Im Gegensatz dazu war die Prionen-Pathogenese in Mfge8-/- Mäusen, die intracerebral inokuliert wurden und damit unabhängig von Prionenreplikation in lymphatischen Organen ist, drastisch beschleunigt. Diese Beschleunigung war mit erhöhten Mengen von PrPSc im Gehirn und einer Reduktion von aktivierten Mikroglia im Cerebellum verbunden. Diese Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass Mfge8 beim mikroglia-abhängigen Abbau von Prionen beteiligt ist.



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Abstract

Summary _____________________________________________________________________________________________________



2 Summary Follicular dendritic cells (FDCs) constitute an important cell type in the germinal center (GC) reaction. They are thought to supply GC B-cells with essential survival signals, drive affinity maturation and control generation and maintenance of memory B-cells. The exact molecular mechanisms of these processes are not well defined and despite their central role in the GC reaction, FDCs are probably one of the most poorly understood cell types of the immune system. Apart from their beneficial role in adaptive immunity FDCs also exert a noxious role in certain pathologies. It is well established that FDCs trap large amounts of HIV virions and thereby contribute to the pathogenesis of AIDS. Furthermore, FDCs also participate in prion diseases by replication and accumulation of disease-associated PrPSc in lymphoid organs. To gain deeper insights into FDC-biology by identifying FDC-specific genes and also to identify important factors necessary for prion replication by FDCs, an unbiased transcriptomic screen has been conducted. One interesting candidate found was the phosphatidylserine (PS)-binding protein Mfge8 (Huber et al., 2005), which was further investigated here. The observation that FDCs of Mfge8-/- mice lacked FDC-M1 expression, one of the most specific markers used to define FDCs, but of unknown identity, led to the discovery that FDC-M1 and Mfge8 are identical. This discovery will enable new methods to study and characterize FDCs. The role of Mfge8 in the removal of apoptotic cells is well established. It binds to PS on the surface of apoptotic cells, which is then recognized by integrins expressed on macrophages. This interaction induces the internalization of the apoptotic cell. Consequently, tingible-body macrophages (TBMφs) of Mfge8-/- mice exhibit a phagocytosis defect leading to impaired removal of apoptotic B-cells from the GC. This was reported to result in systemic lupus erythematosus (SLE) an autoimmune disease with autoantibodies directed against nuclear proteins. However, this report claimed that Mfge8 was produced by TBMφs and not by FDCs (Hanayama et al., 2004). I confute this view in my thesis by a detailed analysis of splenic Mfge8 expression by using reciprocal bone marrow (BM) chimeras between wild-type (WT) and Mfge8-/-

4 Summary _____________________________________________________________________________________________________

mice. In these mice Mfge8 expression was restricted to radioresistant FDCs. Radiosensitive TBMφs failed to show any detectable Mfge8 RNA expression. However, Mfge8 protein was easily detectable in TBMφs when FDCs expressed Mfge8 or when recombinant Mfge8 was injected subcutaneously. The absence of FDC-produced Mfge8 in wild-type Mfge8-/- bone-marrow chimeras resulted in impaired engulfment of apoptotic cells in the GC. The results I present here have led to a novel model of apoptotic cell removal in the GC, in which FDCs produce Mfge8 and opsonize apoptotic cells to target them for removal by TBMφs. Cell death occurs frequently in the GC, but TBMφ-numbers are low, which might be limiting for apoptotic corpse removal. Thus, by supplying TBMφs with detailed topological information where to engulf apoptotic cells FDCs guarantee a rapid and efficient removal of dying cells. Therefore, FDCs may play an active role in the prevention of autoimmunity by ensuring the rapid clearance of cell corpses from the GC. The question whether Mfge8 also contributes to prion pathogenesis was also addressed here. Mfge8 produced by FDCs seemed to have no influence on prion replication and accumulation in lymphoid organs. In contrast to this, Mfge8-/- mice showed a drastically accelerated prion pathogenesis after intracerebral inoculation, where disease progression is independent of prion replication in lymphoid organs. This acceleration was associated with elevated levels of PrPSc in the brain and decreased numbers of activated microglia in the cerebellum. These results indicate that Mfge8 might be involved in microglial-dependent degradation of prions.



5 Zusammenfassung _____________________________________________________________________________________________________



3 Zusammenfassung Follikuläre dendritische Zellen (FDCs) stellen einen wichtigen Zelltyp in der Keimzentrumsreaktion dar. Man nimmt an, dass sie dort B-Zellen mit wichtigen Überlebenssignalen versorgen, die Affinitätsreifung von B-Zellen kontrollieren, sowie die Entstehung und Erhaltung von B-Gedächtniszellen regulieren. Die genauen molekularen Mechanismen dieser Prozesse sind nicht hinreichend bekannt, und trotz ihrer wichtigen Rolle in der Keimzentrumsreaktion, sind FDCs einer der wohl am wenigsten verstandenen Zelltypen des Immunsystems. Ausser ihrer nützlichen Rolle in der adaptiven Immunabwehr, spielen FDCs auch eine schädliche Rolle in bestimmten Krankheiten. Es ist bekannt, dass FDCs grosse Mengen an HIV-Virionen binden und dadurch zur AIDS-Pathogenese beitragen. Desweiteren sind FDCs auch an Prionenerkrankungen beteiligt, indem sie das pathologische PrP-Konformer PrPSc in lymphatischen Organen vermehren und anreichern. Um ein genaueres Verständnis der FDC-Biologie durch die Identifikation FDC- spezifischer Gene zu bekommen und um wichtige Faktoren für die Prionen- replikation zu identifizieren, wurde eine unvoreingenommene Analyse des FDC- Transkriptoms durchgeführt. Ein interessanter Kandidat, der dabei gefunden wurde, war das Phosphatidlyserin (PS)-bindende Protein Mfge8 (Huber et al., 2005), was ich in dieser Arbeit genauer untersucht habe. Meine Beobachtung, dass FDCs von Mfge8-/- Mäusen kein FDC-M1 produzieren, das einen der spezifischsten FDC-Markern darstellt, aber dessen Identität bis dahin unbekannt war, hat zur Identifikation von FDC-M1 als Mfge8 geführt. Diese Entdeckung wird neue Methoden der Erforschung von FDCs ermöglichen. Es ist bekannt, dass Mfge8 an der Beseitigung von apoptotischen Zellen beteiligt ist, indem es an PS an der Oberfläche von apoptotischen Zellen bindet. Anschliessend wird dieser Komplex über Integrine, die von Makrophagen exprimiert werden erkannt, was die Internalisierung der apoptotischen Zellen durch Makrophagen induziert. Folglich zeigen Tingible-Body Makrophagen (TBMφs) von Mfge8-/- Mäusen einen Phagozytose-Defekt, was eine gestörte Beseitigung von apoptotischen Zellen zur Folge hat und schliesslich zu systemischen Lupus Erythematodes (SLE) führt, einer Autoimmunerkrankung, bei der Autoantikörper gegen nukleare Proteine gebildet



6 Zusammenfassung _____________________________________________________________________________________________________

werden. In jener Studie wurde allerdings berichtet, dass Mfge8 von TBMφs und nicht von FDCs produziert wird (Hanayama et al., 2004). Diese Ansicht konnte ich hier durch eine detaillierte Analyse der Mfge8-Expression in der Milz von Knochenmarkschimären zwischen Wildtyp und Mfge8-/- Mäusen widerlegen. Mfge8-Expression konnte in diesen Chimären nur in strahlungs- resistenten FDCs gefunden werden aber nicht in strahlungssensitiven TBMφs. Das Mfge8-Protein war allerdings in TBMφs präsent, wenn FDCs Mfge8 exprimierten oder wenn rekombinantes Mfge8 subkutan injiziert wurde. Die Abwesenheit von FDC- produziertem Mfge8 in Wildtyp Mfge8-/- Knochenmarkschimären beeinträchtigte die Beseitigung apoptotischer Zellen im Keimzentrum. Diese Entdeckung führte zu einer neuen Hypothese zur Beseitigung apoptotischer Zellen im Keimzentrum. Diese Hypothese besagt, dass Mfge8, das von FDCs produziert wird, apoptotische Zellen opsonisiert um sie für die Beseitigung durch TBMφs zu markieren. Im Keimzentrum ist Apoptose häufig, die Zahl der TBMφs aber gering, was auf die Beseitigung apoptotischer Zellen limitierend wirken könnte. Um trotzdem eine effiziente und schnelle Beseitigung der apoptotischen Zellen zu gewährleisten, teilen FDCs den TBMφs genaue topologische Informationen zur Lage von apoptotische Zellen mit, indem sie Mfge8 produzieren. FDCs stellen somit die schnelle Beseitigung apoptotischer Zellen im Keimzentrum sicher und verhindern dadurch vermutlich die Entstehung von Autoimmunerkrankungen. Auch die Frage, ob Mfge8 zur Prionen-Pathogenese beiträgt habe ich hier untersucht. Dabei wurden keine Hinweise darauf gefunden, dass FDC-produziertes Mfge8 die Prionenreplikation oder -anreicherung in lymphatischen Organen beeinflusst. Im Gegensatz dazu war die Prionen-Pathogenese in Mfge8-/- Mäusen, die intracerebral inokuliert wurden und damit unabhängig von Prionenreplikation in lymphatischen Organen ist, drastisch beschleunigt. Diese Beschleunigung war mit erhöhten Mengen von PrPSc im Gehirn und einer Reduktion von aktivierten Mikroglia im Cerebellum verbunden. Diese Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass Mfge8 beim mikroglia-abhängigen Abbau von Prionen beteiligt ist.



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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Aguzzi Adriano
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2008
Deposited On:04 Feb 2009 09:28
Last Modified:24 Sep 2019 15:49
Number of Pages:106
OA Status:Green
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