The role of the ammonia transporter RhCG in systemic acid-base homeostasis

Abstract

Multiple Faktoren, welche durch ein breites Kontinuum vom gesunden Metabolismus bis zu pathologischen Krankheitsbildern bedingt sind, können zu Veränderungen des systemischen Säure-Base-Gleichgewichts führen. Die Ausschüttung von fixen Säure- und Base-Anteilen in den Urin wird durch die Nieren gesteuert, damit spielen diese eine zentrale Rolle in der Regulierung der Homöostase des Blut pH-Wertes. Das Ammonium (NH4+) / Ammoniak (NH3) Puffersystem ist bedeutend für die Korrektur von schwankenden Säureladungen. In den Sammelrohren der Nieren vermitteln Typ A Schaltzellen eine Reduktion von Säure indem sie NH3 und Protonen (H+) aus dem Blut entfernen, während sie gleichzeitig Bikarbonate (HCO3-) produzieren. Die H+-Sekretion wird durch einen aktiven Transport durch die vakuolare H+-ATPase vermittelt. Protonen werden durch NH3 Moleküle im Lumen eingefangen, dabei wird NH4+ im Urin angereichert. Langezeit wurde angenommen, dass es sich dabei lediglich um einen passiven Mechanismus handelt, doch neuere Forschungsergebnisse zeigen, dass der NH3- Transporter RhCG (Rhesus Blutgruppen-assoziiertes C Glykoprotein) eine wichtige Rolle für den Transport von NH3 in den Sammelrohren der Nieren spielt. In säuregeladenen Zuständen können Mäuse, die kein Rhcg (Rhcg-/-) besitzen, nicht die nötige Menge an NH4+ ausscheiden und ihr Urin ist in der Folge stärker alkalisch als beim Wildtyp. Menschen, welche in der Fähigkeit den Urin anzusäuren, eingeschränkt sind, können an einer distalen renal- tubulären Azidose (dRTA) erkranken. Insbesondere Mutationen, welche die Isoform der H+-ATPase der Typ A Schaltzellen im Sammelrohr der Niere betreffen, können in einer erblichen Form der dRTA bei Menschen und Nagern resultieren. Nach einer chronischen Säureanreicherungsperiode, kommt es auch bei Rhcg-/- Mäusen zu einer eingeschränkten Form der dRTA.
Das Ziel dieser Dissertation ist das Verständnis der Wichtigkeit von Rhcg für die Kontrolle der systemischen Säure-Base-Homöostase. Zu diesem Zweck wurden drei Projekte ins Leben gerufen. Als erstes haben wir den Effekt der einzelnen und kompletten Deletion von Rhcg auf den Säure-Base-Haushalt und den NH3-Transport durch Sammelrohrzellen untersucht. Wir haben dazu ein neues Model von Rhcg+/+, +/- und -/- Mäusen, welche während 2 oder 7 Tagen eine HCl (Salzsäure) Diät erhielten, verwendet und analysiert inwiefern ein Rhcg Verlust zur metabolischen Azidose führt. Um sicherzustellen welche Rolle Rhcg auf der basolateralen Seite von Sammelrohrzellen spielt, haben wir den basolateralen Transport von NH3 in mikroperfusionierten kortikalen Sammelrohren von Rhcg+/+, +/- und -/- Mäusen beobachtet. Schliesslich haben wir auch Anpassungsmechanismen in den Nieren von Rhcg+/+, +/- und -/- Mäusen an die HCl Säureladung untersucht. In der Folge haben wir in einem zweiten Projekt an Rhcg+/+, +/- und /- Mäusen die Rolle von Rhcg in einer physiologischen Situation in der eine vermehrte Ausscheidung von NH4+ in den Urin nötig wird, analysiert. Diese Erhöhung wird durch eine, für die westliche Lebensweise typische, proteinreiche Diät gefördert. Schliesslich wurde die Möglichkeit einer Interaktion zwischen Rhcg und der vakuolaren H+-ATPase in den Typ A Schaltzellen mit dem Ziel die unterliegenden molekularen Signalwege, welche für die Ansäuerung des Urins in den Sammelzellen der Nieren verantwortlich sind, zu verstehen, erforscht.
Während sich die Rhcg+/+ und +/- Mäuse an die 2-tägige HCl Säurezufuhr in ihrer Nahrung anpassen konnten, entwickelten die Rhcg-/- Mäuse eine metabolische Azidose mit erniedrigter NH4+ Sekretion und sie produzierten einem stärker alkalischen Urin. Zusätzlich haben auch die Rhcg+/- Mäuse innerhalb von sieben Tagen der HCl Diät eine metabolische Azidose entwickelt und die meisten Rhcg-/- Mäuse starben vor Ende der Säurezufuhrperiode. Die Mikroperfusionsstudien der Sammelrohre der Nieren zeigten, dass die transepithelialen Durchlässigkeiten für NH3 bei Rhcg+/- Tieren zu 54 % und bei Rhcg-/- zu 80 % reduziert wurden, wenn diese mit dem Wildtyp verglichen wurden. Damit bestätigten wir, dass eine 50 %-ige Reduktion der Rhcg Aktivität ausreicht um die Antwort der Sammelrohre auf eine starke Säureanreicherung zu minimieren, in welchem Fall es schliesslich zu einer chronischen metabolischen Azidose kommt. Die apikalen und basalen Permeabilitäten der Sammelzellen der Nieren wurden bei Rhcg- Knockout Mäusen reduziert, was die Funktion von Rhcg im basolateralen Transport von NH3 bestätigt. Rhcg+/- Mäuse zeigten lediglich eine starke Reduktion der apikalen NH3 Permeabilität. Schliesslich stellten wir parallel mit einer verminderten Proteinexpression der Na+/K+/2Cl- Isoform 2 (NKCC2) des Ko-Transporters des dicken aufsteigenden Tubulus der Henle-Schleife, auch eine verminderte NH4+-Konzentration im inneren Markgewebe der Rhcg-/- Mäuse fest, was darauf hinweist, dass Rhcg einen Einfluss auf die Bildung oder Erhaltung des kortikopapillären NH3/NH4+ Gradienten hat.
Proteinreiche Diäten tierischen Ursprungs, welche für den westlichen Lebensstil typisch sind, erhöhen in den Nieren die Ausscheidung von NH4+ in den Urin. Die schädlichen Effekte solcher Diäten, die insbesondere die Knochen und Nierenfunktion beeinträchtigen, wurden bereits in Tiermodellen und auch an Menschen mit normaler und reduzierter Nierenfunktion, untersucht. Die genauen Mechanismen, durch welche proteinreiche Ernährung sich auf die renale Säureausscheidung auswirkt, wurden bisher nicht im Detail etabliert. Wir haben den Einfluss einer säureanreichernden proteinreichen Ernährung wie Käsein auf Rhcg+/+, +/- und -/- Mäuse erforscht. Nach einer vorübergehenden Senkung des Blut-pHs und HCO3- in allen Genotypen, haben wir eine ähnliche Adaptation von Rhcg+/+ und +/- bei einer 9-tägigen proteinreichen Ernährung festgestellt. Die Funktionen des Na+/Glutamin Kotransporters SNAT3 und des ammoniagenen Enzyms PDG (phosphate dependent glutaminase), welches in der Produktion von NH4+ im proximalen Tubulus involviert ist, wurden erhöht. Rhcg-/- Mäuse haben dabei sogar eine stärkere Erhöhung dieser Mechanismen aufgezeigt, was möglicherweise der Kompensation dient. Eine nicht-säurehaltige proteinreiche Ernährung auf der Basis von Soja wurde als Kontrolle verwendet und hat keine Säureladung bei Rhcg+/+, +/- und -/- Mäusen induziert. Bei den Rhcg+/+ Mäusen wurde während einer säurehaltigen Diät, welche auf Käsein basierte, die Expression von NKCC2 und die Isoform 2 des H20-Kanals (AQP2) herunterreguliert, während das Volumen des Urins zunahm. Im Vergleich von Rhcg-/- Mäusen mit Rhcg+/+ Tieren zeigte sich, dass die NKCC2 Protein Expression, sowie die NH4+ Konzentration im Gewebe der inneren Medulla nach 4 Tagen der Käsein-Diät zunahmen, wobei die Expression bei beiden Gruppen nach 9 Tagen abnahm und wiederum höhere Urinvolumen beobachtet wurden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Nieren anfänglich mit einem Anpassungsprozess auf die proteinreiche Diät reagieren, wobei NH4+ direkt in den Urin ausgeschieden wird, diese Anpassung ist bei einem Fehlen von Rhcg eingeschränkt. Schliesslich haben wir bei den Rhcg-/- Mäusen auch erhöhte Zeichen von Knochenresorption in Form von Hyperkalzämie, Hyperkaliurie, und erhöhter Deoxypyridinoline (Dpd) und verminderter Knochendichte in der kortikalen Schicht des Femurs der Versuchstiere als Folge der proteinreichen Diät beobachtet. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit von Rhcg in der Regulierung des physiologischen Säure-Base-Haushalts und lassen uns vermuten, dass Rhcg auch ausserhalb der Niere Einflüsse hat.
Nebst der reduzierten NH4+ Exkretion werden die Rhcg-/- Tiere auch durch einen basischeren Urin charakterisiert. In diesem Zusammenhang konnten wir bei den Rhcg-/- Tieren im Vergleich mit dem Wildtyp auch einen Defekts des NH3 Transports und eine gleichzeitige Verminderung der H+ Sekretion beobachten. Aufgrund dieser Feststellungen wollten wir eine potentielle funktionelle Interaktion zwischen Rhcg und der vakuolaren Multi- Unit-Protein H+-ATPase (H+-ATPase) untersuchen. Die H+-ATPase ist das Haupttransportsystem in den Typ A Schaltzellen der Sammelrohre. Beim Vergleich von Rhcg-/- und +/+ konnten wir keinen Unterschied in der mRNA Expression der Regulation der verschiedenen Untereinheiten der H+-ATPase feststellen, doch die Proteinmenge von B1 war erhöht, während die B2- Isoform durch eine verminderte Proteinmenge charakterisiert wurde. Schliesslich zeigte die Immunogold-Elektronenmikroskopie eine ähnliche intrazelluläre Lokalisation der A-Untereinheit der vakuolaren H+-ATPase. HEK293 Zellen, welche vermehrt RhCG expressionierten, zeichneten sich durch höhere H+-Ströme aus, wenn wie mit Zellen, welche nur vorgetäuscht transfizierten wurden, verglichen wurden und auch die Menge an ATP6V1B1 mRNA war in den Rhcg Zellen erhöht. Schliesslich haben wir auch untersucht, ob der Gebrauch eines H+-ATPase Inhibitors, Cocanamycin, zu einer entgegengesetzten Regulation führen könnte und ob Mäuse, die keine B1-Untereinheit der H+-ATPase (Atp6v1b1-/-) besitzen, eine reduzierte H+- ATPase Aktivität in den Typ A Schaltzellen des Sammelrohres aufzeigen. Der H+-ATPase Inhibitor Concanamycin reduzierte gleichzeitig die Aktivität der H+- ATPAse und Rhcg in mikroperfundierten Sammelrohren. Atp6v1b1-/- Mäuse, welche während 2 Tagen eine HCl Diät erhielten, zeigten im Vergleich mit dem Wildtyp, eine verminderte H+-ATPase Aktivtät, doch die apikale und basolaterale NH3 Permeabilität der Membranen der mikroperfundierten Schaltzellen in den Sammelrohren blieb unverändert, was zum Schluss führt, dass die Reduktion der H+-ATPase Aktivität keinen Einfluss auf die Aktivität von Rhcg hat. Diese Arbeit enthüllt damit eine funktionelle Interaktion, welche von Rhcg abhängig ist. Rhcg ist bedeutend für die volle Funktion der vakuolaren H+-ATPase des Sammelrohrs. Für eine genauere Charakterisierung dieser Interaktion sind weitere Experimente notwendig.
Diese Dissertation bestätigt und erläutert die zentrale Rolle von Rhcg im letzten Schritt der NH4+ Sekretion in den Nieren und eröffnet gleichzeitig neue Perspektiven bezüglich der Rolle von Rhcg in der Regulation des H+- Transports im Sammelrohr der Niere.


Several conditions, from dietary metabolism to various disease states, induce changes of systemic acid-base balance. Excretion of fixed acid or alkali equivalents into urine is directed by the kidneys and critically participates in the regulation of blood pH homeostasis. The ammonium (NH4+) / ammonia (NH3) buffering system plays a major role to correct an extra acid load. In the collecting duct (CD) of kidneys, type-A intercalated cells mediate the removal of acids in the form of NH3 and protons (H +) and produce new bicarbonate (HCO3-). Urinary H+ secretion is mediated by active transport by vacuolar H+-ATPases (H+-ATPases). In the lumen, protons trap NH3 molecules, resulting in NH4+ formation in urine. For long considered as a solely passive mechanism, the transport of NH3 in the collecting duct of kidney is critically mediated by the NH3 transporter RhCG. In acid-loading conditions, mice deficient for Rhcg (Rhcg-/-) are not able to excrete a proper amount of NH4+ and show a more alkaline urine than wildtype animals. In humans, patients with impaired capacity to acidify urine develop distal renal tubular acidosis (dRTA). In particular, mutations affecting isoforms of the H+-ATPase found in kidney CD type-A intercalated cells cause the development of inherited forms of dRTA in humans and rodents. After a chronic acid-loading period, an incomplete form of dRTA also appears in Rhcg-/- mice.
The present dissertation aimed to understand the importance of RhCG in controlling systemic acid-base homeostasis. To this end, three projects were developed. First, using a novel model of Rhcg+/+, +/- and -/- mice receiving a HCl diet for 2 or 7 days, we studied the effect of a single allele or complete deletion of Rhcg on acid-base status and NH3 transport across CCD cells, in order to determine to which extend Rhcg deficiency can induce metabolic acidosis. To clarify the role of Rhcg on the basolateral side of the CD cells, we assessed the basolateral transport of NH3 in microperfusion cortical collecting ducts of Rhcg+/+, +/- and -/- mice. Finally, adaptation mechanisms occurring in kidneys of Rhcg+/+, +/- and -/- mice in response to the HCl acid-load were also inspected. In a second project, we studied Rhcg+/+, +/- and -/- mice to determine the role of Rhcg in conditions of a physiological requirement for enhanced NH4+ excretion into urine, such as the consumption of a high protein diet, which is typical of a western lifestyle. Finally, we examined the possibility of a functional interaction between Rhcg and vacuolar H+-ATPases in type-A intercalated cells of kidneys in order to detail the molecular pathway responsible for urinary acidification in the collecting duct of kidneys.
While Rhcg+/+ and Rhcg+/- were able to adapt a 2-days HCl acid-load in food, Rhcg-/- mice developed metabolic acidosis with lower urinary NH4+ and more alkaline urine. In addition, Rhcg+/- mice also developed metabolic acidosis after 7 days of HCl diet and most of the Rhcg-/- animals died before the end of the acid-loading period. Microperfusion studies of kidney cortical collecting ducts (CCDs) demonstrated that NH3 transepithelial permeability was reduced by 54% and 80% respectively in CCDs from Rhcg+/- and Rhcg-/- mice compared to wildtype, confirming that a 50% reduction of Rhcg activity is enough to impair the kidney collecting duct response to a strong acid-load, and result in chronic metabolic acidosis. The apical but also basolateral permeability of CCD cells of kidneys was reduced in Rhcg knockout mice, attesting for Rhcg function in basolateral transport of NH3. Rhcg+/- mice exhibited a strong reduction in apical NH3 permeability only. Finally, reduced protein expression levels of the Na+/K+/2Cl- isoform 2 (NKCC2) cotransporter expressed in the thick ascending limb of the loop of Henle (TAL) was paralleled by lower concentrations of NH4+ in the inner medullary tissue of Rhcg-/- mice, suggesting an influence of Rhcg on the NH3/NH4+ cortico-papillary gradient formation or maintenance.
High protein diets from animal sources, which characterize the typical western diet, increase urinary NH4+ excretion in kidneys. Harmful effects of protein-rich diets on bone and kidney function have been described in animal models and humans with normal and reduced kidney function. However, mechanisms by which high protein diets act on renal acid excretion have not been examined in detail. We studied the impact of an acid-loading high protein diet as casein (HC diet) on Rhcg+/+, +/- and -/- mice. After a transient decrease of blood pH and HCO3- in all genotypes, we described a similar adaptation to 9 days HC diet in Rhcg+/+ and Rhcg+/- mice, which enhanced the Na+/glutamine co-transporter SNAT3 and the ammoniagenic enzyme PDG (Phosphate Dependent Glutaminase) involved in NH4+ production in the proximal tubule. Rhcg-/- mice displayed an even stronger enhancement of these mechanisms, possibly as compensation. Non-acidogenic high protein diet as soy (HS diet) was used as a control and did not induce an acid-load of Rhcg+/+, +/- and -/- animals. In Rhcg+/+ mice, protein expression levels of NKCC2 and the H2O channel isoform 2 (AQP2) were decreased by the acidogenic HC diet paralleled by increased urinary volume. In Rhcg-/- compared to Rhcg+/+ mice, we observed higher NKCC2 protein expression as well as tissue NH4+ concentration in the inner medulla after 4 days HC diet, but both were lowered after 9 days of the HC diet when higher urinary volumes were also observed. Our data suggest an original adaptive process of the kidney to an acidogenic high protein diet, involving a direct elimination of NH4+ into urine, which seems to be exacerbated by the absence of Rhcg. Our data eventually showed increased signs of bone resorption in Rhcg-/- in the form of hypercalcemia, hypercalciuria, increased deoxypyrydinoline (Dpd) and reduced bone mineral density in the cortical femur layer affected by HC diet. This study demonstrated the importance of Rhcg in the management of a physiological acid- load and suggests extra-renal effects of Rhcg.
In addition to reduced urinary NH4+ excretion, Rhcg-/- mice had more alkaline urine. Accordingly, we observed in microperfused CCD from Rhcg-/- mice a defect in NH3 transport and a decrease in H+ secretion compared to wildtype mice. We thus aimed to study a potential functional interaction between Rhcg and the multi-unit protein vacuolar H+-ATPase (H+-ATPase), which constitutes the main H + transport system in the collecting duct type-A intercalated cells. Rhcg-/- compared to +/+ did not display any differential mRNA expression regulation of various H+-ATPase subunits, but increased protein levels of B1 and reduced levels of the B2 isoform. Moreover, immunogold electron-microscopy demonstrated similar subcellular localization of the ubiquitous A subunit of the vacuolar H+-ATPase. HEK293 cells overexpressing RhCG exhibited higher H+ fluxes compared to mock transfected cells together with enhanced levels of ATP6V1B1 mRNA. Finally, we investigated whether an opposite regulation could also occur by using an H+-ATPase inhibitor, concanamycin, and mice lacking the B1 subunit of the H+-ATPase (Atp6v1b1-/-) that display reduced H+-ATPase activity in CCD type-A intercalated cells. The H+- ATPase inhibitor concanamycin reduced both H+-ATPase and Rhcg activity in microperfused CCDs. However, Atp6v1b1-/- mice receiving 2 days HCl diet had lower H+-ATPase activity than wildtype, but revealed apical and basolateral NH3 membrane permeabilities in microperfused CCD cells comparable to wildtype animals, attesting that a reduced H+-ATPase activity had no impact on Rhcg activity. This study demonstrates a functional interaction where Rhcg is necessary for full function of the vacuolar H+-ATPase in the collecting duct, although further experiments are needed to characterize this interaction.
In conclusion, this work confirms and details the central role of Rhcg in the final step of NH4+ excretion by the kidney and opens new perspectives regarding the role of Rhcg in the regulation of H+ transport by the collecting duct.