Abstract
The multimeric enzyme serine palmitoyltransferase (SPT) catalyzes the first step of the sphingolipid (SL) de novo synthesis, the condensation of palmitoyl-CoA and L-serine to the first sphingoid base sphinganine. Missense mutations in two of three SPT subunits (serine palmitoyltransferase long chain base subunit 1 and 2, SPTLC1 and SPTLC2) cause the rare hereditary sensory and autonomic neuropathy type 1 (HSAN1). HSAN1 is a slowly progressive sensory neuropathy with an onset in adulthood, usually between 2nd and 5th decade. Several disease-causing mutations of SPT increase the promiscuous activity of SPT with the alternative substrates L-alanine and glycine which results in increased formation of neurotoxic 1-deoxysphingolipids (1-deoxySLs). Due to a missing C1 hydroxyl group, 1- deoxySLs can neither be converted to complex sphingolipids nor degraded by the classical pathway. Elevated 1-deoxySL concentrations were consistently found in nerves and plasma of the HSAN1 mouse model and in plasma and lymphoblasts of HSAN1 patients. Increased concentrations of 1-deoxydSLs in plasma represent a reliable biomarker for the diagnosis of SPT-associated HSAN1. Today thirteen different missense mutations of SPTLC1 and SPTLC2 have been conclusively associated with HSAN1. Besides this genotypical variability the phenotypes are also quite diverse.
Several cases with atypical severe symptoms starting in early childhood and even congenital have been reported. Here we report, the case of a patient with a new mutation of serine 331 in SPTLC1 (exchange of serine for tyrosine; p.S331Y). The patient presents severe and atypical symptoms such as: early onset, growth retardation, ocular manifestations and respiratory problems. This phenotype is very similar to the symptoms, caused by another mutation at the same residue (p.S331F). Serine 331 obviously is a crucial residue for SPTLC1 and mutations of this residue cause a distinct and severe syndrome.
Mutations of S331 are rare. Only four patients with mutations of serine 331 have been reported so far and one of them had died at the age of 28years already. In all four cases the mutation did not segregate but had occurred de novo. Our previous work had shown that formation and accumulation of 1-deoxySLs, by mutant-expressing HEK cells, can be effectively prevented by L-serine supplemented medium. We measured significantly reduced 1-deoxySL concentrations, as a result of a dietary L-serine supplementation, in plasma and tissues of the mouse model and also in plasma from HSAN1 patients with the p.C133Y mutation. These promising results raised the hope, that L-serine supplementation might be the first long-term therapy for all SPT-associated HSAN1. We launched and accompanied an experimental L-serine trial with one of the three known S331F patients, to test, whether this therapeutic approach could be used even for this severe case. Repeated measurements of the sphingolipid profile of this patient over two years confirmed our hypothesis. Concentrations of 1-deoxySLs were reduced to 45% of the baseline levels and the patient reported significant improvements in temperature sensation, wound healing, muscle strength, endurance, hair growth and body weight. Once more, this proves the big potential of dietary L-serine supplementation as standard treatment for SPT- associated HSAN1 in general.
Genotypic variability of HSAN1 is high, and several new mutations of SPT are being discovered almost every year. Another missense mutation within SPTLC1 (alanine to valine exchange at position 339, p.A339V) was recently found in a German family. Several members of this family presented mild symptoms of a peripheral neuropathy. We analyzed the sphingolipid profiles of affected and healthy members of this family and found increased concentrations of 1-deoxySLs in all affected individuals. This finding conflicts with the genotypes, as two of the neuropathy patients do not have the mutation and a female carrier of the mutation does not present any symptoms of the disease. A causative role of A339V alone therefore can be excluded. This raises the question, how the 1-deoxySLs in the non- carriers were formed without the involvement of a mutation in SPT.
To better understand the underlying mechanisms of 1-deoxySL formation and the differences between the mutations, we compared the biochemical properties of all known mutations in SPTLC1 and SPTLC2. We used mutant-overexpressing HEK293 cells, metabolic labeling and LC-MS to analyze activity and substrate preference of mutant SPT in different conditions. The canonical activity of SPT was not reduced in any of the mutants and three of them even caused hyperactivity. Eight mutants had significant higher activity with alanine. With the generated dataset, we were able to group the mutations into distinct clusters based on their biochemical properties. This biochemical clustering of the mutants is reflected by the severity of the phenotypes and the sphingolipid profiles in plasma of the affected patents. The formation of 1-deoxySLs is a crucial factor for the neuropathy and the activity of SPT with L-alanine correlates with the severity of the disease. Canonical hyperactivity worsens the effect of 1-deoxySL formation and causes the most severe pathologies.
This thesis highlights the genotypic and phenotypical variability of HSAN1. Our biochemical comparison shows common characteristics of all SPT mutations and provides a comprehensive set of simple experimental methods to determine them. The genotype-phenotype correlation allows forecasts on the course and severity of the disease directly after diagnose. We showed that L-serine supplementation is a promising long term therapy even for the rare and severe cases of HSAN1. We found further strong hints that mutations in SPTLC1 and SPTLC2 might not be the only source for increased 1-deoxySLs in HSAN1 patients. The mechanism of 1-deoxySL formation and regulation of SPT activity is very complex and more work will be necessary to finally unravel its enigmatic nature.
Zusammenfassung Das multimere Enzym Serin palmitoyltransferase (SPT) katalysiert den ersten Schritt der Sphingolipid de novo Synthese, die Kondensation von L-Serin und Palmitoyl-CoA zur ersten Sphingoid Base Sphinganin. Missense-Mutationen in zwei der drei SPT Untereinheiten (Serine palmitoyltransferase long-chain base subunit 1 und 2, SPTLC1 und SPTLC2) verursachen die seltene Hereditäre sensorisch-autonome Neuropathie Typ 1 (HSAN1). HSAN1 ist eine langsam voranschreitende sensorische Neuropathie, die für gewöhnlich erst im Erwachsenenalter zwischen dem 2ten und 5ten Lebensjahrzehnt beginnt. Mehrere krankheitsverursachende Mutationen der SPT steigern die die promiskuitive Aktivität der SPT mit den alternativen Substraten L-Alanin und Glycin, was zu einer gesteigerten Bildung von neurotoxischen 1-Deoxysphingolipiden (1-deoxySL) führt. Aufgrund der fehlenden C1 Hydroxylgruppe, können die 1-deoxySL weder zu komplexen Sphingolipiden umgeandelt, noch über den klassischen Weg abgebaut werden. Erhöhte Konzentrationen von 1- Deoxysphingolipiden wurden immer wieder in Nerven und Plasma des HSAN1 Maus-Modells sowie im Plasma und in Lymphoblasten von HSAN1 Patienten gefunden. Gesteigerte 1- deoxySL-Konzentrationen im Plasma stellen einen zuverlässigen Biomarker für die Diagnose der SPT-verursachten HSAN1 dar. Bis heute wurden dreizehn verschiedene Missense- Mutationen in SPTLC1 und SPTLC2 eindeutig mit HSAN1 assoziiert. Neben dieser genetischen Variabilität sind auch die Phänotypen recht unterschiedlich. Es wurden bereits mehrere Fälle mit aussergewöhnlich schwerwiegenden Symptomen, die auch bereits in der frühen Kindheit oder sogar mit der Geburt einsetzten, gemeldet.
Hier schildern wir den Fall einer Patientin mit einer neuen Mutation von Serin 331 in SPTLC1 (Austausch von Serin gegen Tyrosin, p.S331Y). Die Patientin zeigte schwerwiegende und untypische Symptome wie etwa: frühen Beginn, Wachstumsverzögerung, okuläre Manifestationen und Beeinträchtigung der Atmung. Dieser Phänotyp ähnelt damit sehr den Symptomen, die durch eine weitere Mutation derselben Aminosäure (p.S331F) hervorgerufen werden. Serin 331 ist offensichtlich eine essentiell wichtige Aminosäure für SPTLC1 und Mutationen dieser Aminosäure verursachen ein klar abgegrenztes und schwerwiegendes Syndrom.
Mutationen von S331 sind selten. Bisher wurden lediglich vier Patienten mit Mutationen von Serin 331 berichtet und einer von diesen vier ist bereits im Alter von 28 Jahren verstorben. Die Mutation wurde in allen vier Fällen nicht etwa vererbt, sondern war jeweils neu aufgetreten. Unsere bisherigen Arbeiten hatten bereits gezeigt, dass die Bildung und Akkumulation von 1-Deoxysphingolipiden in HEK-Zellen, welche die Mutationen exprimieren, durch Zugabe von L-Serin zum Medium wirkungsvoll verhindert werden kann. Als Folge einer Nahrungsergänzung mit L-Serin, konnten wir bereits, sowohl in den Nerven und im Plasma des Maus Modells, als auch in HSAN1 Patienten mit der p.C133Y Mutation, deutlich verringerte 1-deoxySL-Konzentrationen messen. Diese vielversprechenden Ergebnisse erweckten die Hoffnung, dass die L-Serin Supplementierung die erste Langzeittherapie für alle SPT-verursachten Fälle von HSAN1 sein könnte.
Um zu überprüfen, ob dieser therapeutische Ansatz auch für diesen schwerwiegenderen Fall verwendet werden kann, haben wir einen L-Serin Versuch mit einem der drei p.S331F- Patienten gestartet und begleitet. Wiederholte Analysen des Sphingolipidprofils dieses Patienten, über einen Zeitraum von zwei Jahren, bestätigten unsere Hypothese. Die 1- deoxySL-Konzentration im Plasma des Patienten ging bis auf 45% des Ausgangswertes zurück und der Patient berichtete deutliche Verbesserungen seiner Temperaturwahrnehmung, seiner Wundheilung, seiner Muskelkraft und Ausdauer, seines Haarwuchses und seines Körpergewichtes. Dies beweist einmal mehr das grosse Potential der L-Serin Supplementation als Standardbehandlung für alle SPT-verursachten Fälle von HSAN1.
Die genetische Variabilität von HSAN1 ist hoch und neue Mutanten der SPT werden fast jedes Jahr entdeckt und gemeldet. Eine weitere Missense-Mutation in SPTLC1 (ein Austausch von Alanin durch Valin an Position 339, p.A339V) wurde kürzlich in einer deutschen Familie entdeckt. Mehrere Familienmitglieder litten unter milden Symptomen einer peripheren Neuropathie. Wir haben die Sphingolipidprofile von betroffenen und gesunden Familienmitgliedern analysiert und dabei erhöhte 1-deoxySL-Konzentrationen in allen betroffenen Individuen gefunden. Diese Entdeckung widerspricht den Genotypen, da zwei der Neuropathiepatienten die Mutation nicht in ihrem Genom tragen und eine weibliche Trägerin der Mutation keinerlei Krankheitssymptome aufweist. Es kann daher ausgeschlossen werden, dass p.A339V alleine die Symptome verursacht. Dies wiederum wirft die Frage auf, wie die 1-deoxySL in den Nicht-Trägern ohne die Beteiligung einer SPT- Mutation gebildet wurden.
Um den zugrunde liegenden Mechanismus der 1-deoxySL-Bildung und die Unterschiede zwischen den verschiedenen Mutationen besser zu verstehen, haben wir die biochemischen Eigenschaften von allen bekannten Mutationen der SPTLC1 und SPTLC2 verglichen. Um die Aktivität und Substratpräferenz der SPT unter verschiedenen Bedingungen zu messen, haben wir HEK293-Zellen verwendet, die die SPT-Mutanten überexprimieren. Nach metabolischer Markierung wurden die gebildeten Sphingolipide mittels LC-MS analysiert. Die kanonische Aktivität der SPT war in keiner der untersuchten Mutanten reduziert und drei Mutationen verursachten sogar Hyperaktivität. Acht Mutanten zeigten eine gesteigerte Aktivität mit Alanin. Mit dem erzeugten Datensatz konnten wir die Mutationen aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften unterschiedlichen Clustern zuordnen. Diese biochemische Zuordnung der Mutanten spiegelt sich auch im Schweregrad der verursachten Phänotypen sowie den Sphingolipidprofilen im Plasma der Patienten wieder. Die Bildung von 1-deoxySL ist ein entscheidender Faktor für die Neuropathie und die Aktivität der SPT mit L-Alanin korreliert mit der Schwere der Erkrankung. Kanonische Hyperaktivität verschlimmert die Wirkung der 1-deoxySL-Bildung zusätzlich und verursacht so letztlich die schwerwiegendsten Pathologien.
Diese Arbeit unterstreicht die genetische und phänotypische Variabilität der HSAN1. Unser Biochemischer Vergleich zeigt die Gemeinsamkeiten aller bekannter SPT Mutationen auf und liefert ein umfassendes Set von einfachen, experimentellen Methoden, um diese zu bestimmen. Die Genotyp-Phänotyp-Korrelation erlaubt die Vorhersage des Verlaufs sowie des Schweregrades der zu erwartenden Symptome direkt nach der Diagnose. Wir haben gezeigt, dass L-Serin Supplementierung selbst für die seltenen, schwerwiegenden Fälle von HSAN1 eine vielversprechende Langzeittherapie darstellt. Wir haben darüber hinaus weitere Hinweise dafür gefunden, dass Mutationen in SPTLC1 und SPTLC2 möglicherweise nicht die einzigen Ursachen für erhöhte 1-deoxySL-Werte sind. Der Mechanismus der 1-deoxySL- Bildung und Regulation der SPT ist sehr komplex und mehr Arbeit wird notwendig sein, um ihre Rätselhaftigkeit endgültig zu entschlüsseln.
Bode, Heiko Sebastian