Abstract
Cytoglobin (Cygb) is a recently discovered member of the mammalian oxygen-binding globin family, in addition to neuroglobin and androglobin and the well-established hemoglobin (Hb) and myoglobin (Mb). Cygb is evolutionary antecedent to Hb and Mb, with which it shares ~30% homology. In contrast to Hb and Mb and, similar to neuroglobin and androglobin, Cygb displays hexa-coordination of the heme iron, implying a role other than oxygen distribution. Cygb is ubiquitously expressed in a wide variety of organs, including heart, brain, liver and kidney, and occurs predominantly in the fibroblast cell lineage, as well as in some neuron populations. Despite extensive research efforts, its physiological role remains unknown, but possible functions include reactive oxygen species (ROS) detoxification and signaling. ROS are detrimental for many diseases, including diabetic nephropathy (DN), a chronic complication of diabetes. Hyperglycemia-induced ROS are responsible for glomerular injuries, such as podocyte apoptosis and/or detachment, which contribute to development of proteinuria.
We aimed to investigate the patho-physiological role of CYGB in the kidney, particularly at the podocyte level, using the human podocyte cell line AB8/13, which expresses abundant endogenous Cygb mRNA levels compared to other kidney-derived cell lines. We established stable CYGB knock-down cell lines using two independent shRNA sequences. These CYGB-deficient podocytes displayed an increase in cell death, as assessed by independent approaches (trypan blue exclusion method, MTT assays, PARP cleavage and TUNEL assays). Moreover, CYGB knock-down cells showed increased accumulation of ROS, as assessed by H2DCFDA assays and the redox sensitive probe roGFP2-Orp1 at basal levels and upon different stimuli, including antimycin A, H2O2 and high glucose treatments. RNA-sequencing based transcriptome analysis of control and Cygb knock-down cells identified dysregulation of multiple genes involved in apoptosis and redox balance. Interestingly, gene array expression analysis of biopsies from chronic kidney disease (CKD) patients showed a pronounced CYGB induction in diabetic nephropathy, validated by RT-qPCR in independent samples. Moreover, genome-wide association studies revealed that CYGB is potentially implicated in CKD. In order to validate our findings in vivo, streptozotocin-induced diabetic nephropathy and ischemia/reperfusion kidney injury on a Cygb knock-out mouse model have been initiated.
The identification of CYGB transcript variants with unknown physiological functions added further complexity to our understanding of CYGB regulation. Among five distinct transcript variants, we focused on a transcript that displays an alternative first exon located 10 kb upstream of the canonical one, termed CYGB-A1. In AB8/13 podocytes, CYGB-A1 displayed lower expression levels compared to CYGB, but appeared to be differentially regulated at transcriptional level, particularly upon oxidative stress.
In conclusion, we demonstrated that Cygb protects podocytes from oxidative stress and cell death. We identified an alternative CYGB transcript variant, regulated by oxidative stress in podocytes and potentially involved in the anti-oxidative function of CYGB. We suggest for the first time the association of CYGB with CKD, particularly with diabetic nephropathy, which is currently under investigation using in vivo models. The confirmation of a putative involvement of CYGB will contribute to an improved understanding of how an oxygen-binding globin can take part in the complexity of oxygen and ROS signaling in the diseased kidney.
Zusammenfassung: Cytoglobin (Cygb) gehört zur Proteinfamilie der Sauerstoff-bindenden Globine, welche auch Hämoglobin (Hb), Myoglobin (Mb), Androglobin und Neuroglobin umfasst. Cygb ist ein evolutionärer Vorläufer von Hb und Mb und teilt ~ 30% Homologie mit diesen. Im Gegensatz zu Hb und Mb, und ähnlich wie Neuroglobin und Androglobin, ist das Häm-Eisen in Cygb hexakoordiniert, was auf eine andere Funktion als Sauerstoffverteilung hindeutet. Cygb wird ubiquitär in einer Vielzahl von Organen, einschliesslich Herz, Gehirn, Leber und Niere, exprimiert und tritt vorwiegend in fibroblastischen Zellen, sowie in einigen Neuronenpopulationen auf. Trotz intensiver Forschung ist seine physiologische Rolle bislang unbekannt, aber potentielle Funktionen involvieren die Entfernung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) aus der Zelle und ROS-abhängige Signaltransduktion. ROS sind in vielen Krankheiten, einschliesslich diabetischer Nephropathie (DN), einer chronischen Komplikation von Diabetes, involviert. Hyperglykämie-induzierte ROS führen zur Beschädigung von Glomeruli, wie etwa Apoptose und/oder Ablösung von Podozyten, was zur Entwicklung von Proteinurie beitragen kann. Ziel dieses Projektes war es, die pathophysiologische Rolle von CYGB in der Niere, und insbesondere in Podozyten zu untersuchen. Dafür wurde die humane Podozyten-Zelllinie AB8/13 verwendet, welche im Vergleich mit anderen renalen Zelllinien hohe Spiegel endogener CYGB mRNA exprimiert. Unter Verwendung zweier unabhängiger shRNA Sequenzen haben wir stabile CYGB knock-down Zellen hergestellt. Diese CYGB-defizienten Podozyten haben eine erhöhte Zelltod-Rate, was wir mit unabhängigen Methoden (MTT-Test, PARP-Spaltung und TUNEL-Assay) zeigen konnten. CYGB knock-down Zellen zeigten zudem eine vermehrte Akkumulation von ROS, wie durch H2DCFDA Assays und mittels der redox-sensitiven Sonde roGFP2-Orp1 sowohl basal als auch auf verschiedene Stimuli, wie Antimycin A, H2O2 und erhöhte Glucosekonzentration hin, gezeigt wurde. Durch RNA-Sequenzierung basierte Transkriptom-Analyse von Kontroll- und CYGB knock-down-Zellen konnten wir mehrere Gene identifizieren, welche als Folge des Cygb knock-downs dysreguliert und in Apoptose und Redox-Gleichgewicht involviert sind. Interessanterweise zeigte die Gen Array-Analyse von Biopsien von Patienten mit chronischer Nierenerkrankung (CKD) eine ausgeprägte Induktion von CYGB in Patienten mit diabetischer Nephropathie, was durch RT-qPCR in unabhängigen Proben validiert werden konnte. Darüber hinaus zeigten genomweite Assoziationsstudien, dass CYGB potenziell in der CKD involviert ist. Um diese Ergebnisse in vivo zu validieren, wurde die Untersuchung von Cygb knock-out Mäusen in zwei unterschiedlichen Mausmodellen für Nierenschäden, Streptozotocin-induzierter diabetischer Nephropathie und Ischämie/Reperfusion, initiiert. Die Identifizierung von weiteren CYGB Transkript-Varianten mit unbekannten physiologischen Funktionen erhöht die Vielschichtigkeit der Regulation von CYGB zusätzlich. Wir haben eine von fünf verschiedenen Splice-Varianten näher untersucht. Diese besitzt ein alternatives erstes Exon 10 kb obenhalb des kanonischen ersten Exons und wird als CYGB-A1 bezeichnet wird. In AB8/13 Podozyten zeigt CYGB-A1 im Vergleich zu Cygb eine niedrigere Expression und wird vor allem unter oxidativem Stress unterschiedlich reguliert.
Abschliessend lässt sich sagen, dass CYGB Podozyten vor oxidativem Stress und Zelltod schützt. Wir haben eine alternative Transkript-Variante von CYGB identifiziert, die durch oxidativen Stress in Podozyten reguliert und potenziell an der antioxidativen Funktion von CYGB beteiligt ist. Wir beschreiben zum ersten Mal eine Assoziation von CYGB mit CKD, insbesondere mit diabetischer Nephropathie, welche wir derzeit mit Hilfe von in vivo Modellen weiter untersuchen. Eine Bestätigung dieser Beteiligung von CYGB wird unser Wissen und Verständnis von Nierenerkrankungen und der Rolle eines Sauerstoff-bindenden den Globins in der komplexen Regulation der Sauerstoff- und ROS-abhängigen Signaltransduktion erweitern.
Randi, Elisa