Abstract
During senescence, chlorophyll (chl) is degraded through a well described pathway to be detoxified and to allow remobilization of nitrogen from the photosystems. One of the major steps in chl breakdown is the opening of the porphyrin ring via the coupled reaction of pheophorbide a oxygenase (PAO) and the red chl catabolite reductase (RCCR). Product of this reaction, a fluorescent catabolite (pFCC) is occurring in the chloroplast, whereas, the final products, non fluorescent catabolites of chl are located in the vacuole. The first objective of this work was to identify the transporter involved in pFCC export out of the chloroplast. A primary active ATP dependent transporter, AtWBC23 was shown to be one of the major transporters involved in this process. Most of enzymatic steps of degradation of chl are well known, however, regulation of the pathway is still only partially described. We characterized the stay-green factor (SGR, At4g22920) as a key element of chl degradation regulation. Moreover, intensive characterization of SGR mutants allowed to identify and characterize one of Mendel’s pea lines as being defective in SGR. In addition, major advances in SGR function in relation to the PAO pathway were achieved. In summary, these investigations demonstrate that SGR functions upstream and independent of PAO. In a third part, I was more interested in characterizing the PAO/RCCR reaction. Thereby an additional protein required in the known reaction was molecularly identified and characterized. This factor could contribute to substrate channeling through PAO/RCCR by detoxifying reactive oxygen species formed in the PAO reaction. During my PhD thesis, I worked on several aspects of chl breakdown, i.e. transport, regulation and catabolism, which considerably improved our understanding of how important proper chl degradation is to avoid phototoxic lesion formation. Further work will be required to show whether such a chl metabolic process is also responsible for chl turnover in green mature leaves
Chlorophyll wird während der Seneszenz abgebaut, um mit seiner Entgiftung der Pflanze Stickstoff aus den Fotosystemen zu Verfügung zu stellen. Im wichtigsten Schritt des Chlorophyllabbaus öffen die Enzyme Pheophorbid a Oxygenase (PAO) und „Roter Chlorophyll Katabolit“ Reduktase (RCCR) den Porphyrinring des Chlorophyllmoleküls. Während sich das fluoreszierende Produkt dieser Reaktion (pFCC) im Chloroplasten befindet, werden nicht fluoreszierende Endprodukte in der Vakuole gelagert. Ein Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung eines möglichen Transporters, der pFCC aus dem Chloroplasten transportieren könnte. Dabei konnte das ATP abhängige Transporterprotein AtWBC23 (At5g06530) als Haupttransporter von pFCC identifiziert werden. Der Ablauf des enzymatischen Chlorophyllabbaus ist gut beschrieben, jedoch über die Regulation dieses Prozesses ist noch wenig bekannt. Ich charakterisierte den „Stay-Green“ Faktor (SGR, At4g22920), eines der Schlüsselenzyme in der Chlorophyllabbauregulation. Durch diese Untersuchung wurde herausgefunden, dass eine der von Mendel benutzten Erbsensorten (i) einen Defekt in der Produktion von SGR aufweist. Weiter konnte die Funktion von SGR im Zusammenhang mit dem PAO-abhängigen Abbauweg besser beschrieben werden. SGR funktioniert unabhängig und vor PAO im Chlorophyllabbau. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die PAO/RCCR Reaktion genauer untersucht. Es wurde ein zusätzliches Protein identifiziert, das für diese Reaktion benötigt wird. Es handelt sich um eine Peroxidase, die den durch PAO produzierten reaktiven Sauerstoff entgiftet. Während meiner Dissertation interessierten mich verschiedene Aspekte des Chlorophyllabbaus, vor allem der Transport, die Regulation und der Abbau selbst. Diese Arbeit zeigt, wie wichtig ein gut funktionierender Chlorophyllabbau ist, um durch die Entgiftung der phototoxischen Abbauprodukte die Bildung von Lesionen zu verhindern. Zukünftige Forschung muss zeigen, ob der Chlorophyllabbau via PAO/RCCR nur während der Seneszenz geschieht oder auch schon in den grünen Blättern der Pflanze.
Aubry, Sylvain