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PrfA activation at the single cell level in Listeria monocytogenes


Peterhans, Sophie Eugenie. PrfA activation at the single cell level in Listeria monocytogenes. 2017, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Vetsuisse Faculty University of Zurich (2017)

Sophie Eugenie Peterhans

Institute for Food Safety and Hygiene ils@fsafety.uzh.ch

PrfA activation at the single cell level in Listeria monocytogenes

The human pathogen Listeria monocytogenes is able to transition from environmental saprophyte to facultative intracellular bacteria. In this process, virulence gene expression is controlled by the positive regulatory factor A (PrfA). Recent studies at the single cell level have shown that gene expression in response to stress exposure is stochastic in individual bacteria cells. Current studies applied those general findings to Listeria cells, revealing that PrfA as well is not regulated consistently, but that PrfA activity differs between individual cells. The aim of this study was to elucidate the mechanism by which Listeria regulates PrfA activation at the single cell level and whether this property is heritable or not. A reporter fusion, namely an eGFP sequence, integrated following the PrfA dependent promoter (Phly), was used to visualize the activation after heat stress exposure. Fluorescence activated cell sorting (FACS) was used to distinguish PrfA positive and negative cells. After passaging and sorting PrfA activating versus non-activating cells over several generations, two stable fluorescent phenotypes emerged. A comparison between the genome of the PrfA positive and its parent strain revealed a single-nucleotide polymorphism (SNP) in the CDS of LMRG_02823, as well as a mutation in the 5'UTR of LMRG_00195, both LPXTG family cell wall associated proteins regulated via small RNAs. The link between those mutations and PrfA activation is currently being investigated.

Key words: Listeria monocytogenes, PrfA, single cell, stochastic gene regulation, FACS

Listeria monocytogenes ist einerseits ein saprophytäres Umweltbakterium, kann aber auch als fakultativ intrazelluläres Pathogen agieren. Die Virulenzgenexpression von L. monocytogenes wird hauptsächlich über den Mastertranskriptionsfaktor PrfA reguliert. Forschungsarbeiten der letzten zehn Jahre haben gezeigt, dass die Genexpression auf Einzelzellebene nicht wie erwartet immer nach dem gleichen Schema abläuft, sondern bei den individuellen Zellen je nach Stressreiz variiert. Eine aktuelle Studie hat diese Erkenntnisse auf L. monocytogenes angewandt, mit dem Ziel, die Aktivierung von PrfA durch die einzelne Bakterienzelle zu untersuchen. Und auch hier scheinen die Zellen eine gewisse Autonomie zu besitzen. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, wie und weshalb eine einzelne Listerienzelle den Mastertranskriptionsfaktor PrfA aktiviert und inwiefern diese Aktivierungseigenschaft “vererbt” ist. Mittels einer Reporter Fusion, genauer eGFP gekoppelt an den PrfA abhängigen Promoter des hly Gens (Phly), wurde die stressinduzierte PrfA Aktivierung sichtbar gemacht. Mithilfe der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie (FACS) wurde die Zellpopulation in PrfA positiv und negativ unterteilt. Durch weiteres Passagieren dieser Subpopulationen entstanden zwei klare Phänotypen: solche die PrfA stärker aktieren und solche mit einer tieferen Aktivierungsrate. Mittels PacBio Sequencing wurde versucht den Ursprung dieser Phänotypen auszumachen. Wir fanden im PrfA+ Stamm (ILS G3-0005) PrfA in seiner Wildtyp-Form vor, was die Hypothese der Heritabilität bestätigt. Des Weiteren wurde einerseits ein Einzelnukleotid-Polymorphismus in der 5'UTR von Lmo1799 identifiziert, welche die Zielsequenz für eine sRNA, genannt Rli27, darstellt. Die zweite Mutation befindet sich in der 5'UTR von Lmo0514, einem Internalin der LPXTG Familie. Wir konnten jedoch bis anhin keine Verbindung zum PrfA positiven Phänotyp des Stammes ILS G3-0005 herstellen.

Schlüsselwörter: Listeria monocytogenes, PrfA, Einzelzelle, stochastische Genregulation, Fluoreszenz-Durchflusszytometrie

Abstract

Vetsuisse Faculty University of Zurich (2017)

Sophie Eugenie Peterhans

Institute for Food Safety and Hygiene ils@fsafety.uzh.ch

PrfA activation at the single cell level in Listeria monocytogenes

The human pathogen Listeria monocytogenes is able to transition from environmental saprophyte to facultative intracellular bacteria. In this process, virulence gene expression is controlled by the positive regulatory factor A (PrfA). Recent studies at the single cell level have shown that gene expression in response to stress exposure is stochastic in individual bacteria cells. Current studies applied those general findings to Listeria cells, revealing that PrfA as well is not regulated consistently, but that PrfA activity differs between individual cells. The aim of this study was to elucidate the mechanism by which Listeria regulates PrfA activation at the single cell level and whether this property is heritable or not. A reporter fusion, namely an eGFP sequence, integrated following the PrfA dependent promoter (Phly), was used to visualize the activation after heat stress exposure. Fluorescence activated cell sorting (FACS) was used to distinguish PrfA positive and negative cells. After passaging and sorting PrfA activating versus non-activating cells over several generations, two stable fluorescent phenotypes emerged. A comparison between the genome of the PrfA positive and its parent strain revealed a single-nucleotide polymorphism (SNP) in the CDS of LMRG_02823, as well as a mutation in the 5'UTR of LMRG_00195, both LPXTG family cell wall associated proteins regulated via small RNAs. The link between those mutations and PrfA activation is currently being investigated.

Key words: Listeria monocytogenes, PrfA, single cell, stochastic gene regulation, FACS

Listeria monocytogenes ist einerseits ein saprophytäres Umweltbakterium, kann aber auch als fakultativ intrazelluläres Pathogen agieren. Die Virulenzgenexpression von L. monocytogenes wird hauptsächlich über den Mastertranskriptionsfaktor PrfA reguliert. Forschungsarbeiten der letzten zehn Jahre haben gezeigt, dass die Genexpression auf Einzelzellebene nicht wie erwartet immer nach dem gleichen Schema abläuft, sondern bei den individuellen Zellen je nach Stressreiz variiert. Eine aktuelle Studie hat diese Erkenntnisse auf L. monocytogenes angewandt, mit dem Ziel, die Aktivierung von PrfA durch die einzelne Bakterienzelle zu untersuchen. Und auch hier scheinen die Zellen eine gewisse Autonomie zu besitzen. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, wie und weshalb eine einzelne Listerienzelle den Mastertranskriptionsfaktor PrfA aktiviert und inwiefern diese Aktivierungseigenschaft “vererbt” ist. Mittels einer Reporter Fusion, genauer eGFP gekoppelt an den PrfA abhängigen Promoter des hly Gens (Phly), wurde die stressinduzierte PrfA Aktivierung sichtbar gemacht. Mithilfe der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie (FACS) wurde die Zellpopulation in PrfA positiv und negativ unterteilt. Durch weiteres Passagieren dieser Subpopulationen entstanden zwei klare Phänotypen: solche die PrfA stärker aktieren und solche mit einer tieferen Aktivierungsrate. Mittels PacBio Sequencing wurde versucht den Ursprung dieser Phänotypen auszumachen. Wir fanden im PrfA+ Stamm (ILS G3-0005) PrfA in seiner Wildtyp-Form vor, was die Hypothese der Heritabilität bestätigt. Des Weiteren wurde einerseits ein Einzelnukleotid-Polymorphismus in der 5'UTR von Lmo1799 identifiziert, welche die Zielsequenz für eine sRNA, genannt Rli27, darstellt. Die zweite Mutation befindet sich in der 5'UTR von Lmo0514, einem Internalin der LPXTG Familie. Wir konnten jedoch bis anhin keine Verbindung zum PrfA positiven Phänotyp des Stammes ILS G3-0005 herstellen.

Schlüsselwörter: Listeria monocytogenes, PrfA, Einzelzelle, stochastische Genregulation, Fluoreszenz-Durchflusszytometrie

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Stephan Roger
Communities & Collections:05 Vetsuisse Faculty > Institute of Food Safety and Hygiene
UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:630 Agriculture
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2017
Deposited On:14 Feb 2018 16:28
Last Modified:08 Feb 2019 15:17
Number of Pages:36
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod010889449&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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