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Functional Regulation of the Deubiquitinase OTUB1 by the Oxygen Sensing Hydroxylase FIH


Pickel, Christina. Functional Regulation of the Deubiquitinase OTUB1 by the Oxygen Sensing Hydroxylase FIH. 2019, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Für das Überleben von Zellen und Organismen ist es von entscheidender Bedeutung, Veränderungen der Sauerstoffverfügbarkeit in ihrer Umgebung zu erfassen, um ihren Energiestoffwechsel entsprechend anzupassen. Der Sauerstoffsensor Factor inhibiting HIF (FIH), eine Asparagin-Hydroxylase, reguliert die Transaktivierungsaktivität des Hypoxia inducible factor (HIF), dem Hauptregulator der zellulären, transkriptionell regulierten Anpassung an Hypoxie. FIH Knockout-Mäuse haben einen metabolischen Phänotyp, der zumindest teilweise unabhängig von HIF ist. Die Identifizierung weiterer FIH-Zielproteine deutet darauf hin, dass Asparagin-Hydroxylierungen nicht auf HIF beschränkt sind. Die funktionellen Folgen dieser Modifikationen sowie ihre Rolle für den Phänotyp der Knockout-Maus sind jedoch weitgehend unklar.
In dieser Doktorarbeit wurde das molekulare Zusammenspiel zwischen FIH und dem zuvor identifizierten, potenziellen Substratprotein Ovarian tumour domain containing, ubiquitin aldehyde binding protein 1 (OTUB1) untersucht. Mit Hilfe von massenspektrometrischen Untersuchungen und in vitro Hydroxylierungsassays konnten wir zeigen, dass OTUB1 von FIH an Asn22 hydroxyliert wird. OTUB1 ist eine Deubiquitinase, die spezifisch Lys48-verknüpfte Polyubiquitinketten hydrolysiert. Während die Hydroxylierung die katalytische Aktivität von OTUB1 nicht beeinflusste, wurde die Bindung von Substratproteinen reguliert, was zu Veränderungen im zellulären Energiestoffwechsel führte. Untersuchungen des OTUB1-abhängigen zellulären Metaboloms zeigten einen breit gefächerten Effekt der Proteinspiegel von OTUB1 auf verschiedenste Metabolite. Das steht im Einklang mit vorherigen Beschreibungen von OTUB1 als Interaktionspartner verschiedener Stoffwechselenzyme. Damit wird eine neuartige, HIF-unabhängige Verknüpfung zwischen zellulären Sauerstoffsensoren, dem Ubiquitin-System und der Regulierung von Stoffwechselprozessen hergestellt.
Wir beobachteten zusätzlich, dass FIH und OTUB1 einen aussergewöhnlich stabilen Komplex bilden. Die Charakterisierung dieses Komplexes zeigte, dass die Proteine kovalent, wahrscheinlich durch eine Amid-Bindung, verknüpft sind und dass die Bildung des Komplexes abhängig von der FIH-Aktivität ist, was auf eine neuartige Amid-Synthase-Aktivität von FIH hindeutet. Die Kinetik der Bildung und des Abbaus des FIH-OTUB1-Komplexes war langsam und die Bildung zeigte eine für FIH bisher nicht bekannte Sensitivität gegenüber der Sauerstoffverfügbarkeit. Dies impliziert einen neuartigen Mechanismus zur Anpassung an chronische Veränderungen der Sauerstoffspiegel. Die enzymatische Aktivität von OTUB1 innerhalb des stabilen Komplexes bleibt erhalten, aber seine Regulation durch E2 Ubiquitin-konjugierende Enzyme ist verändert. Massenspektrometrische Analysen deuteten weiterhin darauf hin, dass die stabile Komplexbildung nicht auf OTUB1 beschränkt ist, sondern wahrscheinlich mit einer spezifischen Subgruppe von FIH-Interaktoren stattfindet.
Insgesamt wurden zwei neue Arten der Regulation der Deubiquitinase OTUB1 durch FIH identifiziert, welche funktionelle Konsequenzen für die Substratbindung beziehungsweise die enzymatische Aktivität von OTUB1 haben. Beide Mechanismen verknüpfen den Sauerstoffsensor FIH mit der Regulation des Ubiquitin-Systems und des zellulären Energiestoffwechsels und liefern Hinweise auf HIF-unabhängige Funktionen von FIH. Darüber hinaus beschreiben wir einen neuartigen Mechanismus zur Messung der Sauerstoffverfügbarkeit und entsprechenden Signalweiterleitung mit Relevanz für die zelluläre Anpassung an chronische Hypoxie.

For the survival of cells and organisms, it is of vital importance to sense changes in oxygen availability in their microenvironment in order to adapt their energy metabolism appropriately. The oxygen sensing asparagine hydroxylase “factor inhibiting HIF” (FIH) regulates the transactivation activity of the hypoxia inducible factor (HIF), the master regulator of the cellular transcriptional response to hypoxia. FIH knockout mice present with a metabolic phenotype which is at least partly independent of HIF. The identification of novel FIH target proteins demonstrated that asparagine hydroxylation is not restricted to HIF. However, the functional consequences and role of these modifications for the knockout mouse phenotype are largely unclear.
Here, we investigated the molecular interplay between FIH and the previously identified potential substrate “ovarian tumour domain containing, ubiquitin aldehyde binding protein1” (OTUB1). Using mass spectrometry and in vitro hydroxylation assays, we demonstrated that OTUB1 is hydroxylated on Asn22 in an FIH-dependent manner. OTUB1 is a deubiquitinase specifically hydrolysing Lys48-linked polyubiquitin chains. While hydroxylation of OTUB1 did not affect its catalytic activity, its substrate targeting was regulated, leading to changes in cellular energy metabolism. We further assessed the OTUB1-dependent cellular metabolome and observed a broad effect of OTUB1 levels on various metabolites, which is in line with previous descriptions of OTUB1 as an interactor of diverse metabolic enzymes. This provides a novel link between oxygen sensing, the ubiquitin system and regulation of metabolic processes independent of HIF.
We additionally observed that FIH and OTUB1 form an unusually stable complex. Characterisation of this complex demonstrated that the proteins are linked covalently, likely by an amide bond, and that formation depends on FIH activity, suggesting a novel amide synthase activity of FIH. The formation and degradation kinetics of the FIH-OTUB1 complex were slow, and the formation demonstrated an unprecedented sensitivity of FIH to oxygen availability, implying a novel mechanism for adaptation to chronic changes in oxygen levels. OTUB1 enzymatic activity was retained within the complex, but its regulation by E2 ubiquitin-conjugating enzymes was altered. Mass spectrometric analyses further suggested that stable complex formation is not restricted to OTUB1 but likely occurs with a distinct subset of FIH interactors.
In summary, we identified two novel modes of regulation of the deubiquitinase OTUB1 by FIH, which have functional consequences for the substrate targeting or enzymatic activity of OTUB1, respectively. These mechanisms link the oxygen sensing hydroxylase FIH with the regulation of the ubiquitin system and cellular energy metabolism and provide evidence for HIF-independent functions of FIH. Moreover, we describe a novel mechanism of oxygen-dependent sensing and signalling with implications for chronic hypoxia adaptation.

Abstract

Für das Überleben von Zellen und Organismen ist es von entscheidender Bedeutung, Veränderungen der Sauerstoffverfügbarkeit in ihrer Umgebung zu erfassen, um ihren Energiestoffwechsel entsprechend anzupassen. Der Sauerstoffsensor Factor inhibiting HIF (FIH), eine Asparagin-Hydroxylase, reguliert die Transaktivierungsaktivität des Hypoxia inducible factor (HIF), dem Hauptregulator der zellulären, transkriptionell regulierten Anpassung an Hypoxie. FIH Knockout-Mäuse haben einen metabolischen Phänotyp, der zumindest teilweise unabhängig von HIF ist. Die Identifizierung weiterer FIH-Zielproteine deutet darauf hin, dass Asparagin-Hydroxylierungen nicht auf HIF beschränkt sind. Die funktionellen Folgen dieser Modifikationen sowie ihre Rolle für den Phänotyp der Knockout-Maus sind jedoch weitgehend unklar.
In dieser Doktorarbeit wurde das molekulare Zusammenspiel zwischen FIH und dem zuvor identifizierten, potenziellen Substratprotein Ovarian tumour domain containing, ubiquitin aldehyde binding protein 1 (OTUB1) untersucht. Mit Hilfe von massenspektrometrischen Untersuchungen und in vitro Hydroxylierungsassays konnten wir zeigen, dass OTUB1 von FIH an Asn22 hydroxyliert wird. OTUB1 ist eine Deubiquitinase, die spezifisch Lys48-verknüpfte Polyubiquitinketten hydrolysiert. Während die Hydroxylierung die katalytische Aktivität von OTUB1 nicht beeinflusste, wurde die Bindung von Substratproteinen reguliert, was zu Veränderungen im zellulären Energiestoffwechsel führte. Untersuchungen des OTUB1-abhängigen zellulären Metaboloms zeigten einen breit gefächerten Effekt der Proteinspiegel von OTUB1 auf verschiedenste Metabolite. Das steht im Einklang mit vorherigen Beschreibungen von OTUB1 als Interaktionspartner verschiedener Stoffwechselenzyme. Damit wird eine neuartige, HIF-unabhängige Verknüpfung zwischen zellulären Sauerstoffsensoren, dem Ubiquitin-System und der Regulierung von Stoffwechselprozessen hergestellt.
Wir beobachteten zusätzlich, dass FIH und OTUB1 einen aussergewöhnlich stabilen Komplex bilden. Die Charakterisierung dieses Komplexes zeigte, dass die Proteine kovalent, wahrscheinlich durch eine Amid-Bindung, verknüpft sind und dass die Bildung des Komplexes abhängig von der FIH-Aktivität ist, was auf eine neuartige Amid-Synthase-Aktivität von FIH hindeutet. Die Kinetik der Bildung und des Abbaus des FIH-OTUB1-Komplexes war langsam und die Bildung zeigte eine für FIH bisher nicht bekannte Sensitivität gegenüber der Sauerstoffverfügbarkeit. Dies impliziert einen neuartigen Mechanismus zur Anpassung an chronische Veränderungen der Sauerstoffspiegel. Die enzymatische Aktivität von OTUB1 innerhalb des stabilen Komplexes bleibt erhalten, aber seine Regulation durch E2 Ubiquitin-konjugierende Enzyme ist verändert. Massenspektrometrische Analysen deuteten weiterhin darauf hin, dass die stabile Komplexbildung nicht auf OTUB1 beschränkt ist, sondern wahrscheinlich mit einer spezifischen Subgruppe von FIH-Interaktoren stattfindet.
Insgesamt wurden zwei neue Arten der Regulation der Deubiquitinase OTUB1 durch FIH identifiziert, welche funktionelle Konsequenzen für die Substratbindung beziehungsweise die enzymatische Aktivität von OTUB1 haben. Beide Mechanismen verknüpfen den Sauerstoffsensor FIH mit der Regulation des Ubiquitin-Systems und des zellulären Energiestoffwechsels und liefern Hinweise auf HIF-unabhängige Funktionen von FIH. Darüber hinaus beschreiben wir einen neuartigen Mechanismus zur Messung der Sauerstoffverfügbarkeit und entsprechenden Signalweiterleitung mit Relevanz für die zelluläre Anpassung an chronische Hypoxie.

For the survival of cells and organisms, it is of vital importance to sense changes in oxygen availability in their microenvironment in order to adapt their energy metabolism appropriately. The oxygen sensing asparagine hydroxylase “factor inhibiting HIF” (FIH) regulates the transactivation activity of the hypoxia inducible factor (HIF), the master regulator of the cellular transcriptional response to hypoxia. FIH knockout mice present with a metabolic phenotype which is at least partly independent of HIF. The identification of novel FIH target proteins demonstrated that asparagine hydroxylation is not restricted to HIF. However, the functional consequences and role of these modifications for the knockout mouse phenotype are largely unclear.
Here, we investigated the molecular interplay between FIH and the previously identified potential substrate “ovarian tumour domain containing, ubiquitin aldehyde binding protein1” (OTUB1). Using mass spectrometry and in vitro hydroxylation assays, we demonstrated that OTUB1 is hydroxylated on Asn22 in an FIH-dependent manner. OTUB1 is a deubiquitinase specifically hydrolysing Lys48-linked polyubiquitin chains. While hydroxylation of OTUB1 did not affect its catalytic activity, its substrate targeting was regulated, leading to changes in cellular energy metabolism. We further assessed the OTUB1-dependent cellular metabolome and observed a broad effect of OTUB1 levels on various metabolites, which is in line with previous descriptions of OTUB1 as an interactor of diverse metabolic enzymes. This provides a novel link between oxygen sensing, the ubiquitin system and regulation of metabolic processes independent of HIF.
We additionally observed that FIH and OTUB1 form an unusually stable complex. Characterisation of this complex demonstrated that the proteins are linked covalently, likely by an amide bond, and that formation depends on FIH activity, suggesting a novel amide synthase activity of FIH. The formation and degradation kinetics of the FIH-OTUB1 complex were slow, and the formation demonstrated an unprecedented sensitivity of FIH to oxygen availability, implying a novel mechanism for adaptation to chronic changes in oxygen levels. OTUB1 enzymatic activity was retained within the complex, but its regulation by E2 ubiquitin-conjugating enzymes was altered. Mass spectrometric analyses further suggested that stable complex formation is not restricted to OTUB1 but likely occurs with a distinct subset of FIH interactors.
In summary, we identified two novel modes of regulation of the deubiquitinase OTUB1 by FIH, which have functional consequences for the substrate targeting or enzymatic activity of OTUB1, respectively. These mechanisms link the oxygen sensing hydroxylase FIH with the regulation of the ubiquitin system and cellular energy metabolism and provide evidence for HIF-independent functions of FIH. Moreover, we describe a novel mechanism of oxygen-dependent sensing and signalling with implications for chronic hypoxia adaptation.

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Additional indexing

Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Scholz Carsten, Wenger Roland H
Communities & Collections:04 Faculty of Medicine > Institute of Physiology
07 Faculty of Science > Institute of Physiology
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
610 Medicine & health
Language:English
Date:2019
Deposited On:25 Jan 2019 11:14
Last Modified:30 Jan 2019 08:07
OA Status:Closed

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