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Optimised bacterial expression of three DNA quality control proteins, the checkpoint proteins Rad9, Rad1 and Hus1


Willi, Barbara. Optimised bacterial expression of three DNA quality control proteins, the checkpoint proteins Rad9, Rad1 and Hus1. 2003, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Die drei Checkpoint-Proteine Rad9, Rad1 und Hus1 spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der replizierten DNA an Kontrollpunkten (checkpoints) des Zellzyklus. Diese werden als Folge eines DNA-Schadens aktiviert, verlangsamen oder stoppen die DNA- Replikation und koordinieren die DNA-Reparaturmechanismen. Wenn diese Kontrollmechanismen der Zelle versagen, kann dies zur Instabilität des Genoms führen und damit letzten Endes zur Entwicklung von Krebs beitragen. Für biochemische Untersuchungen und Strukturanalysen von Rad9, Rad1 und Hus1 sind lösliche und funktionell aktive Proteine erforderlich. Es ist jedoch bekannt, dass diese drei Checkpoint-Proteine in E.coli ausserordentlich schwierig zu exprimieren sind und bisher nur wenige und unvollständige Daten darüber publiziert wurden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene E. coli Stämme getestet, hauptsächlich spezielle E.coli BL21-Codon Plus Stämme, welche gewisse Aminosäure-Codons in hohem Masse exprimieren. Ausserdem wurden unterschiedliche Fusionspartner und Expressionsbedingungen für die drei Checkpoint-Proteine getestet, um auf empirischem Weg optimale Bedingungen für deren bakterielle Produktion zu etablieren. Zusammenfassend kann ausgesagt werden, dass E.coli BL21-Codon Plus Stämme sich eignen, um genügende Mengen der zwei Checkpoint-Proteine Rad1 und Rad9, sowie in beschränktem Ausmass Hus1 zu isolieren, wobei deren korrekte Faltung durch deren gegenseitige spezifische und direkte Interaktion in vitro gezeigt werden konnte.

The human checkpoint proteins Rad9, Rad1 and Hus1 are three DNA quality control proteins that play a critical role in cell cycle checkpoint signalling pathways. These checkpoints are activated due to DNA damage, slow down cell cycle progression and coordinate DNA repair. Failure of this cell cycle surveillance mechanism can cause genomic instability which could eventually lead to cancer formation in mammals. Soluble and functionally active proteins are required for biochemical and structural analysis of Rad9, Rad1 and Hus1. It is known that these three checkpoint proteins are extraordinarily difficult to express in E.coli and only little and incomplete data was collected on their bacterial expression. In this thesis different E.coli-strains were used focussing on special E.coli BL21- Codon Plus strains, which selectively express certain amino-acids in abundance. Furthermore, different fusion partners and expression conditions were tested for each individual checkpoint protein in order to empirically establish optimised expression conditions. In summary, E.coli BL21-Codon Plus strains are a suitable system for the production of the two checkpoint proteins Rad1 and Rad9, and to some extent also of Hus1, whereas their proper folding was shown by their direct and specific interaction in vitro.

Abstract

Die drei Checkpoint-Proteine Rad9, Rad1 und Hus1 spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der replizierten DNA an Kontrollpunkten (checkpoints) des Zellzyklus. Diese werden als Folge eines DNA-Schadens aktiviert, verlangsamen oder stoppen die DNA- Replikation und koordinieren die DNA-Reparaturmechanismen. Wenn diese Kontrollmechanismen der Zelle versagen, kann dies zur Instabilität des Genoms führen und damit letzten Endes zur Entwicklung von Krebs beitragen. Für biochemische Untersuchungen und Strukturanalysen von Rad9, Rad1 und Hus1 sind lösliche und funktionell aktive Proteine erforderlich. Es ist jedoch bekannt, dass diese drei Checkpoint-Proteine in E.coli ausserordentlich schwierig zu exprimieren sind und bisher nur wenige und unvollständige Daten darüber publiziert wurden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene E. coli Stämme getestet, hauptsächlich spezielle E.coli BL21-Codon Plus Stämme, welche gewisse Aminosäure-Codons in hohem Masse exprimieren. Ausserdem wurden unterschiedliche Fusionspartner und Expressionsbedingungen für die drei Checkpoint-Proteine getestet, um auf empirischem Weg optimale Bedingungen für deren bakterielle Produktion zu etablieren. Zusammenfassend kann ausgesagt werden, dass E.coli BL21-Codon Plus Stämme sich eignen, um genügende Mengen der zwei Checkpoint-Proteine Rad1 und Rad9, sowie in beschränktem Ausmass Hus1 zu isolieren, wobei deren korrekte Faltung durch deren gegenseitige spezifische und direkte Interaktion in vitro gezeigt werden konnte.

The human checkpoint proteins Rad9, Rad1 and Hus1 are three DNA quality control proteins that play a critical role in cell cycle checkpoint signalling pathways. These checkpoints are activated due to DNA damage, slow down cell cycle progression and coordinate DNA repair. Failure of this cell cycle surveillance mechanism can cause genomic instability which could eventually lead to cancer formation in mammals. Soluble and functionally active proteins are required for biochemical and structural analysis of Rad9, Rad1 and Hus1. It is known that these three checkpoint proteins are extraordinarily difficult to express in E.coli and only little and incomplete data was collected on their bacterial expression. In this thesis different E.coli-strains were used focussing on special E.coli BL21- Codon Plus strains, which selectively express certain amino-acids in abundance. Furthermore, different fusion partners and expression conditions were tested for each individual checkpoint protein in order to empirically establish optimised expression conditions. In summary, E.coli BL21-Codon Plus strains are a suitable system for the production of the two checkpoint proteins Rad1 and Rad9, and to some extent also of Hus1, whereas their proper folding was shown by their direct and specific interaction in vitro.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hübscher Ulrich, Lutz H
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2003
Deposited On:02 May 2019 13:38
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:68
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod004606556&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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Language: English
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