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Isolierung von NF-κB-abhängigen Enhanceosomen mittels Oligo-Pulldown Assay


Kälin, Fabian. Isolierung von NF-κB-abhängigen Enhanceosomen mittels Oligo-Pulldown Assay. 2003, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

NF-kappaB spielt als induzierbarer Transkriptionsfaktor bei Entzündung, Krebs und anderen Krankheiten eine zentrale Rolle. Obwohl NF-kappaB einer der am besten untersuchten Transkriptionsfaktoren ist, ist wenig darüber bekannt, wie NF-kappaB durch Bindung an seine Promotorsequenz die Transkription der entsprechenden Gene stimuliert. Um diese Vorgänge genauer zu erforschen, wurde in dieser Dissertation ein Versuchsystem auf der Basis eines Oligo-Pulldown Assays etabliert, um NF-kappaB-abhängige Enhanceosomen mittels DNS-Sonden aus nukleären Zellextrakten zu isolieren. Zuerst wurde NF-kappaB mit einer synthetischen NF-kappaB- Konsensussequenz aus HeLa Zellen isoliert und die Spezifität der NF-kappaB-Bindung an die DNS- Sonde nachgewiesen. Für den Einsatz von natürlich vorkommenden Promotorsequenzen als DNS- Sonden (TLR-2-Promotor der Maus und HIV-LTR) mussten die Versuchsbedingungen weiter optimiert werden. Der Einsatz von gezielt mutierten Promotorsequenzen ermöglichte zudem den Nachweis von Proteinen, welche eine Sequenz-spezifische Bindung zeigten. Zwei dieser Proteine wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert: Die Proteine KIAA1455 und Splicing factor proline/glutamine rich (polypyrimidine tract binding protein associated) wurden mit der HIV- LTR- Sequenz aus Jurkat bzw. THP-1 Zellen isoliert. Zusätzlich wurde demonstriert, dass sich der Oligo- Pulldown Assay auch zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen am Promotor eines Gens eignete. Mit einem modifizierten Oligo-Pulldown Assay konnte gezeigt werden, dass IkappaBalpha zwar die Bindung von NF-kappaB an dessen Bindungssequenz verhinderte, nicht aber die Dissoziation von gebundenem NF-kappaB von der DNS bewirkte.

NF-kappaB is a highly inducible transcription factor that plays an important role in inflammation, carcinogenesis and many other diseases. NF-kappaB is one of the most studied transcription factors. But there is still little known about the mechanisms which enable NF-kappaB to stimulate gene transcription after binding to the corresponding promoter sequence. To study these processes in detail, a new experimental system that based on an oligo-pulldown assay and allowed the isolation of NF-kappaB-dependent enhanceosomes from nuclear cell extracts with DNA probes was set up in this thesis project. First, NF-kappaB was isolated from HeLa cells with a synthetic NF-kappaB consensus sequence and the specificity of NF-kappaB binding to the DNA probe was confirmed. To be able to use naturally occurring promoter sequences as DNA probes (murine TLR-2 promoter and HIV-LTR) the experimental conditions of the assay had to be further optimised. Additionally, the use of specifically mutated promoter sequences allowed the detection of proteins that displayed sequence- specific binding characteristics. Two of these proteins were identified by mass spectrometry: The proteins KIAA1455 and Splicing factor proline/glutamine rich (polypyrimidine tract binding protein associated) were isolated with the HIV-LTR sequence from Jurkat and THP-1 cells, respectively. Additionally, it was demonstrated that the oligo- pulldown assay could also be adapted for the study of protein-protein interactions at the site of the promoter of a specific gene. In a modified oligo- pulldown assay it was shown that IkappaBalpha prevented the binding of NF-kappaB to the corresponding binding site, but was not able to dissociate bound NF-kappaB from the DNA template.

Abstract

NF-kappaB spielt als induzierbarer Transkriptionsfaktor bei Entzündung, Krebs und anderen Krankheiten eine zentrale Rolle. Obwohl NF-kappaB einer der am besten untersuchten Transkriptionsfaktoren ist, ist wenig darüber bekannt, wie NF-kappaB durch Bindung an seine Promotorsequenz die Transkription der entsprechenden Gene stimuliert. Um diese Vorgänge genauer zu erforschen, wurde in dieser Dissertation ein Versuchsystem auf der Basis eines Oligo-Pulldown Assays etabliert, um NF-kappaB-abhängige Enhanceosomen mittels DNS-Sonden aus nukleären Zellextrakten zu isolieren. Zuerst wurde NF-kappaB mit einer synthetischen NF-kappaB- Konsensussequenz aus HeLa Zellen isoliert und die Spezifität der NF-kappaB-Bindung an die DNS- Sonde nachgewiesen. Für den Einsatz von natürlich vorkommenden Promotorsequenzen als DNS- Sonden (TLR-2-Promotor der Maus und HIV-LTR) mussten die Versuchsbedingungen weiter optimiert werden. Der Einsatz von gezielt mutierten Promotorsequenzen ermöglichte zudem den Nachweis von Proteinen, welche eine Sequenz-spezifische Bindung zeigten. Zwei dieser Proteine wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert: Die Proteine KIAA1455 und Splicing factor proline/glutamine rich (polypyrimidine tract binding protein associated) wurden mit der HIV- LTR- Sequenz aus Jurkat bzw. THP-1 Zellen isoliert. Zusätzlich wurde demonstriert, dass sich der Oligo- Pulldown Assay auch zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen am Promotor eines Gens eignete. Mit einem modifizierten Oligo-Pulldown Assay konnte gezeigt werden, dass IkappaBalpha zwar die Bindung von NF-kappaB an dessen Bindungssequenz verhinderte, nicht aber die Dissoziation von gebundenem NF-kappaB von der DNS bewirkte.

NF-kappaB is a highly inducible transcription factor that plays an important role in inflammation, carcinogenesis and many other diseases. NF-kappaB is one of the most studied transcription factors. But there is still little known about the mechanisms which enable NF-kappaB to stimulate gene transcription after binding to the corresponding promoter sequence. To study these processes in detail, a new experimental system that based on an oligo-pulldown assay and allowed the isolation of NF-kappaB-dependent enhanceosomes from nuclear cell extracts with DNA probes was set up in this thesis project. First, NF-kappaB was isolated from HeLa cells with a synthetic NF-kappaB consensus sequence and the specificity of NF-kappaB binding to the DNA probe was confirmed. To be able to use naturally occurring promoter sequences as DNA probes (murine TLR-2 promoter and HIV-LTR) the experimental conditions of the assay had to be further optimised. Additionally, the use of specifically mutated promoter sequences allowed the detection of proteins that displayed sequence- specific binding characteristics. Two of these proteins were identified by mass spectrometry: The proteins KIAA1455 and Splicing factor proline/glutamine rich (polypyrimidine tract binding protein associated) were isolated with the HIV-LTR sequence from Jurkat and THP-1 cells, respectively. Additionally, it was demonstrated that the oligo- pulldown assay could also be adapted for the study of protein-protein interactions at the site of the promoter of a specific gene. In a modified oligo- pulldown assay it was shown that IkappaBalpha prevented the binding of NF-kappaB to the corresponding binding site, but was not able to dissociate bound NF-kappaB from the DNA template.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hottiger Michael, Nägeli Hanspeter, Naegeli H
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:German
Place of Publication:Zürich
Date:2003
Deposited On:03 May 2019 07:38
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:81
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod004672083&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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Language: German
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