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Co-expression of a functional clamp loader complex in Escherichia coli : construction of an expression operon for the five subunits of human replication factor C


Kuonen, Sibylle. Co-expression of a functional clamp loader complex in Escherichia coli : construction of an expression operon for the five subunits of human replication factor C. 2003, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Das Clamp Loader Protein Replikationsfaktor C (RF-C) spielt eine wichtige Rolle bei der DNA- Replikation und Zellzyklus-Regulation. In dieser Arbeit wurde ein System für die Überexprimierung von rekombinantem menschlichen RF-C in E. coli entwickelt und optimiert. Mit einer mehrstufigen Klonierungsstrategie wurden die fünf RF-C Gene in einen pET21a Vektor unter die Kontrolle des T7- Promoters kloniert. Das Vektorkonstrukt wurde in einem E. coli Stamm exprimiert, der zusätzlich von E. coli selten benutzte tRNAs überexprimiert, um die Bevorzugung gewisser Codons zu vermeiden. Bei der Expression von RF-C erwiesen sich der niedrige Expressionsgrad, die Unlöslichkeit des Zielproteins und die schnelle Degradation von RF-C p140 als problematisch. Die Induktionsbedingungen mussten sehr gründlich optimiert werden, um eine akzeptable Menge an löslichem, undegradiertem RF-C zu erhalten. Der rekombinante RF-C, welcher zwei Untereinheiten mit 6 x His-tag enthielt, wurde in zwei Stufen aus dem bakteriellen Zellextrakt gereinigt: Auf einen Phosphozellulose- folgte direkt ein Nickel-Reinigungsschritt. Die Enzymaktivität des rekombinanten RF-C wurde mittels DNA Polymerase holoenzyme Assays mit zirkulärer oder linearer DNA getestet. Zusätzlich wurde die ATP-abhängige Clamp-loading-Aktivität in einem [32P]-PCNA loading Assay bestätigt. In allen Versuchen zeigte der rekombinante RF-C die gleichen enzymatischen Eigenschaften, wie sie von aus Säugerzellen gereinigtem RF-C bekannt sind. Zudem wurde gezeigt, dass bakteriell überexprimierter RF-C nicht mit bakteriellen Exo- oder Endonukleasen kontaminiert war und für zukünftige in vitro Replikations- und Reparaturversuche, welche DNA enthalten, verwendet werden kann.

The clamp loader protein replication factor C (RF-C) plays an important role in DNA replication and cell cycle regulation. In this thesis project a system for the overexpression of recombinant human RF- C in an E. coli host was developed and optimised. A multi-step cloning strategy was designed to clone the five RF-C genes into a pET21a vector under the control of the strong T7 promoter. This vector construct was expressed in an E. coli strain which additionally overexpresses tRNAs that are rarely used in E. coli to prevent codon-bias. The major obstacles during the expression of RF-C were the low expression level, the insolubility of the target protein and the rapid degradation of RF-C p140. The induction conditions had to be thoroughly optimised to obtain a reasonable amount of soluble, full- length RF-C. Recombinant RF-C, which contained two 6 x His-tagged subunits, was purified from bacterial cell extracts in a two step purification scheme: A phosphocellulose purification step was immediately followed by a nickel purification step. The enzymatic activity of recombinant RF-C was tested in DNA polymerase holoenzyme assays on a circular and a linear DNA template, respectively. Additionally, the ATP-dependent clamp loading activity was confirmed in a [32P]-PCNA loading assay. In all activity assays recombinant RF-C displayed the same enzymatic properties as it is known for RF-C purified from natural sources. It was also shown that bacterially overexpressed RF-C was not contaminated by bacterial exo- or endonucleases to assure that the quality of recombinant RF-C was sufficient for its future application in in vitro replication or repair activity assays which contain DNA.

Abstract

Das Clamp Loader Protein Replikationsfaktor C (RF-C) spielt eine wichtige Rolle bei der DNA- Replikation und Zellzyklus-Regulation. In dieser Arbeit wurde ein System für die Überexprimierung von rekombinantem menschlichen RF-C in E. coli entwickelt und optimiert. Mit einer mehrstufigen Klonierungsstrategie wurden die fünf RF-C Gene in einen pET21a Vektor unter die Kontrolle des T7- Promoters kloniert. Das Vektorkonstrukt wurde in einem E. coli Stamm exprimiert, der zusätzlich von E. coli selten benutzte tRNAs überexprimiert, um die Bevorzugung gewisser Codons zu vermeiden. Bei der Expression von RF-C erwiesen sich der niedrige Expressionsgrad, die Unlöslichkeit des Zielproteins und die schnelle Degradation von RF-C p140 als problematisch. Die Induktionsbedingungen mussten sehr gründlich optimiert werden, um eine akzeptable Menge an löslichem, undegradiertem RF-C zu erhalten. Der rekombinante RF-C, welcher zwei Untereinheiten mit 6 x His-tag enthielt, wurde in zwei Stufen aus dem bakteriellen Zellextrakt gereinigt: Auf einen Phosphozellulose- folgte direkt ein Nickel-Reinigungsschritt. Die Enzymaktivität des rekombinanten RF-C wurde mittels DNA Polymerase holoenzyme Assays mit zirkulärer oder linearer DNA getestet. Zusätzlich wurde die ATP-abhängige Clamp-loading-Aktivität in einem [32P]-PCNA loading Assay bestätigt. In allen Versuchen zeigte der rekombinante RF-C die gleichen enzymatischen Eigenschaften, wie sie von aus Säugerzellen gereinigtem RF-C bekannt sind. Zudem wurde gezeigt, dass bakteriell überexprimierter RF-C nicht mit bakteriellen Exo- oder Endonukleasen kontaminiert war und für zukünftige in vitro Replikations- und Reparaturversuche, welche DNA enthalten, verwendet werden kann.

The clamp loader protein replication factor C (RF-C) plays an important role in DNA replication and cell cycle regulation. In this thesis project a system for the overexpression of recombinant human RF- C in an E. coli host was developed and optimised. A multi-step cloning strategy was designed to clone the five RF-C genes into a pET21a vector under the control of the strong T7 promoter. This vector construct was expressed in an E. coli strain which additionally overexpresses tRNAs that are rarely used in E. coli to prevent codon-bias. The major obstacles during the expression of RF-C were the low expression level, the insolubility of the target protein and the rapid degradation of RF-C p140. The induction conditions had to be thoroughly optimised to obtain a reasonable amount of soluble, full- length RF-C. Recombinant RF-C, which contained two 6 x His-tagged subunits, was purified from bacterial cell extracts in a two step purification scheme: A phosphocellulose purification step was immediately followed by a nickel purification step. The enzymatic activity of recombinant RF-C was tested in DNA polymerase holoenzyme assays on a circular and a linear DNA template, respectively. Additionally, the ATP-dependent clamp loading activity was confirmed in a [32P]-PCNA loading assay. In all activity assays recombinant RF-C displayed the same enzymatic properties as it is known for RF-C purified from natural sources. It was also shown that bacterially overexpressed RF-C was not contaminated by bacterial exo- or endonucleases to assure that the quality of recombinant RF-C was sufficient for its future application in in vitro replication or repair activity assays which contain DNA.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hübscher Ulrich, Lutz Hans
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2003
Deposited On:03 May 2019 07:39
Last Modified:15 Apr 2021 14:57
Number of Pages:73
OA Status:Green

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