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The tumour suppressor protein flap endonuclease 1 interacts physically with the heterotrimeric checkpoint protein complex Rad9, Rad1 and Hus1


Tännler, Barbara. The tumour suppressor protein flap endonuclease 1 interacts physically with the heterotrimeric checkpoint protein complex Rad9, Rad1 and Hus1. 2004, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Die Zelle verfügt über sehr ausgeklügelte Zellzykluskontrollsysteme, um DNA Schäden festzustellen. Der heterotrimere Proteinkomplex Rad9, Rad1 and Hus1, bezeichnet als den '9-1-1 Komplex', hat eine Schlüsselstelle in solchen Kontrollsystemen. Der '9-1-1 Komplex' hat strukturelle Ähnlichkeiten mit dem ringförmiges Homotrimer Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Von PCNA weiss man, dass es mit dem Tumorsuppressorprotein Flap endonuclease 1 (Fen1) einen Komplex bildet, dessen Rolle in der DNA Replikation und verschieden Reparaturmechanismen bekannt ist. Das Ziel dieser Dissertation war es, die Interaktion zwischen dem '9-1-1 Komplex' und Fen1 zu charakterisieren. Der '9-1-1 Komplex' wurde aus Sf9 Zellen isoliert, die mit 3 Baculoviren infiziert worden waren. Die Viren enthielten die DNA von den rekombinanten Proteinen hRad9, hRad1 und hHus1 und wurden in den Zellen überexprimiert. Mittels 'pull down' Experimenten und 'Farwestern Blot' Analysen konnte gezeigt werden, dass Fen1 physisch sowohl mit dem '9-1-1 Komplex' aus Extrakt von Sf9 Zellen als auch mit gereinigtem '9-1-1 Komplex' interagiert. Die Bindung geschieht über den C-Terminus von Fen1. Dieses Ergebnis ist auch vom evolutionären Standpunkt aus interessant, hat nämlich weder das Fen1 Homolog in Archaea einen C-Terminus noch wurden in diesen Organismen Checkpoint Proteine gefunden. Um zu testen, ob die Azetylierung von Fen1 einen Einfluss auf die Interaktion mit dem '9-1-1 Komplex' hat, wurde ein 'pull down' Experiment mit in vitro azetyliertem Fen1 durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestärken die Hypothese, dass der '9-1-1 Komplex' eine wichtige Funktion in der DNA Reparatur hat.

The cell possesses very sophisticated cell cycle checkpoint pathways to survey the different phases of the cell cycle including cell division and to detect DNA damages. The heterotrimeric protein complex Rad9, Rad1 and Hus1, called the '9-1-1 complex', is an important key player in such checkpoint pathways. The '9-1-1 complex' exhibits structural similarity with the homotrimeric clamp formed by proliferating cell nuclear antigen (PCNA). PCNA is known to form a complex with the tumour suppressor protein flap endonuclease 1 (Fen1). The goal of this study was to characterize the interaction of the '9-1-1 complex' with Fen1, an enzyme involved in DNA replication and various repair mechanisms. For this purpose the human '9-1-1 complex' was isolated by co-expressing the three baculovirus encoding the recombinant Rad9, Rad1 and Hus1 in Sf9 cells. In pull down experiments and by far western blot analysis it was shown that Fen1 physically interacts with the '9-1- 1 complex' from Sf9 cell extract as well as with the purified '9-1-1 complex'. The binding seems to occur through the Fen1 C-terminus. These findings are also interesting form a evolutionary point of view since the Archaea homologue of Fen1 is missing its C-terminus and no checkpoint proteins are found in this early organisms. Previous studies from our laboratory documented that acetylation of Fen1 is increased upon UV damage. To test if this has an effect on the binding to the '9-1-1 complex' a pull down experiment with in vitro acetylated Fen1 was performed. In summary, the results presented in this work support the hypothesis that the '9-1-1 complex' has an important role in DNA repair.

Abstract

Die Zelle verfügt über sehr ausgeklügelte Zellzykluskontrollsysteme, um DNA Schäden festzustellen. Der heterotrimere Proteinkomplex Rad9, Rad1 and Hus1, bezeichnet als den '9-1-1 Komplex', hat eine Schlüsselstelle in solchen Kontrollsystemen. Der '9-1-1 Komplex' hat strukturelle Ähnlichkeiten mit dem ringförmiges Homotrimer Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Von PCNA weiss man, dass es mit dem Tumorsuppressorprotein Flap endonuclease 1 (Fen1) einen Komplex bildet, dessen Rolle in der DNA Replikation und verschieden Reparaturmechanismen bekannt ist. Das Ziel dieser Dissertation war es, die Interaktion zwischen dem '9-1-1 Komplex' und Fen1 zu charakterisieren. Der '9-1-1 Komplex' wurde aus Sf9 Zellen isoliert, die mit 3 Baculoviren infiziert worden waren. Die Viren enthielten die DNA von den rekombinanten Proteinen hRad9, hRad1 und hHus1 und wurden in den Zellen überexprimiert. Mittels 'pull down' Experimenten und 'Farwestern Blot' Analysen konnte gezeigt werden, dass Fen1 physisch sowohl mit dem '9-1-1 Komplex' aus Extrakt von Sf9 Zellen als auch mit gereinigtem '9-1-1 Komplex' interagiert. Die Bindung geschieht über den C-Terminus von Fen1. Dieses Ergebnis ist auch vom evolutionären Standpunkt aus interessant, hat nämlich weder das Fen1 Homolog in Archaea einen C-Terminus noch wurden in diesen Organismen Checkpoint Proteine gefunden. Um zu testen, ob die Azetylierung von Fen1 einen Einfluss auf die Interaktion mit dem '9-1-1 Komplex' hat, wurde ein 'pull down' Experiment mit in vitro azetyliertem Fen1 durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestärken die Hypothese, dass der '9-1-1 Komplex' eine wichtige Funktion in der DNA Reparatur hat.

The cell possesses very sophisticated cell cycle checkpoint pathways to survey the different phases of the cell cycle including cell division and to detect DNA damages. The heterotrimeric protein complex Rad9, Rad1 and Hus1, called the '9-1-1 complex', is an important key player in such checkpoint pathways. The '9-1-1 complex' exhibits structural similarity with the homotrimeric clamp formed by proliferating cell nuclear antigen (PCNA). PCNA is known to form a complex with the tumour suppressor protein flap endonuclease 1 (Fen1). The goal of this study was to characterize the interaction of the '9-1-1 complex' with Fen1, an enzyme involved in DNA replication and various repair mechanisms. For this purpose the human '9-1-1 complex' was isolated by co-expressing the three baculovirus encoding the recombinant Rad9, Rad1 and Hus1 in Sf9 cells. In pull down experiments and by far western blot analysis it was shown that Fen1 physically interacts with the '9-1- 1 complex' from Sf9 cell extract as well as with the purified '9-1-1 complex'. The binding seems to occur through the Fen1 C-terminus. These findings are also interesting form a evolutionary point of view since the Archaea homologue of Fen1 is missing its C-terminus and no checkpoint proteins are found in this early organisms. Previous studies from our laboratory documented that acetylation of Fen1 is increased upon UV damage. To test if this has an effect on the binding to the '9-1-1 complex' a pull down experiment with in vitro acetylated Fen1 was performed. In summary, the results presented in this work support the hypothesis that the '9-1-1 complex' has an important role in DNA repair.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hübscher Ulrich, Althaus Felix
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2004
Deposited On:23 May 2019 11:56
Last Modified:15 Apr 2021 14:57
Number of Pages:51
OA Status:Green

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