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Downregulation of PARP-1 expression by RNA interference


Cohausz, Odile. Downregulation of PARP-1 expression by RNA interference. 2004, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Poly(ADP)polymerasen (PARPs) sind Proteine, die die Synthese von ADP-Ribose Polymeren katalysieren und unterschiedliche Rollen bei verschiedenen zellulären Funktionen spielen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein System zu entwickeln, dass die Downregulation von PARP- Proteinen mittels RNA Interferenz (RNAi) in Zellkulturen ermöglicht. Die Bedingungen für ein effizientes Gen Silencing wurden zunächst für PARP-1 ermittelt. Die Verminderung der PARP-1 Proteinmenge in Fibroblasten von der Maus wurde mittels zweier unterschiedlicher Techniken getestet. Die erste Methode basiert auf der Verwendung von DNA Plasmiden, die die siRNA Moleküle in den Zellen exprimieren, die zweite Methode auf der direkten Transfektion von in vitro hergestellter siRNA. Die zweite Methode ergab die besseren Ergebnisse. Es wurden sechs siRNAs Sequenzen von PARP- 1 auf ihr Silencing Vermögen hin untersucht. Immunoblot Analysen zeigten, dass die unterschiedlichen siRNA Moleküle in der Lage waren, die PARP-1 Expression von 35 % bis mehr als 98 % der ursprünglichen Level zu reduzieren. Der Effekt wurde nach 24 Stunden sichtbar und hielt bis mindestens 72 Stunden nach der Transfection an. Das Silencing von PARP-1zeigte unter normalen Wachstumsbedingungen keinen offensichtlichen Phenotyp; jedoch waren die mit siRNA behandelten Zellen resistenter gegenüber oxidativem Stress als die Wildtyp Zellen. Die vorliegende Studie zeigt die notwendigen Bedingungen für ein effizientes Silencing von PARP-1 in Zellkulturen; diese Methode wird die Basis für weitere Untersuchungen sein, die letztendlich zur Identifikation der Funktion von PARP-1, und mehr allgemein, zur Funktion der Poly(ADP-Ribose) Synthese, als Antwort auf DNA Schäden, führen.

Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) are enzymes that catalyze the synthesis of ADP-ribose polymers, covalently bound to acceptor proteins and play important roles in various cellular functions. This thesis work was aimed at setting up conditions for specific silencing of individual PARPs in living cells using RNA interference (RNAi). To knock-down PARP-1, the most abundant member of the PARP family, in mouse embryonic fibroblasts (MEFs), two approaches out of the various techniques for RNAi were tested. One approach involved the use of DNA plasmids which express siRNA within the cells and the second approach was based on the direct transfection of in vitro transcribed siRNAs. IThe latter approach gave the best results. Six different PARP-1 targenting siRNAs were tested for their ability to downregulate PARP-1 expression. Immunoblotting analyses revealed that siRNA molecules, targeting different positions on PARP-1 mRNA, were able to reduce PARP-1 expression from 35 % to more than 98 % of basal levels within 24 hours and that the silencing effect persists at least up to 72 hours after transfection. Post-transcriptional silencing of PARP-1 by RNAi did not cause any obvious phenotype under normal growth conditions; however, silenced cells appeared to be more resistant against oxidative stress than wild-type cells. In conclusion, these studies establish conditions for effective PARP-1 silencing in cultured cells; this will provide an essential background for further investigations on the role of PARP-1 and, more generally, of poly (ADP-ribose) synthesis, in the response to DNA damage.

Abstract

Poly(ADP)polymerasen (PARPs) sind Proteine, die die Synthese von ADP-Ribose Polymeren katalysieren und unterschiedliche Rollen bei verschiedenen zellulären Funktionen spielen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein System zu entwickeln, dass die Downregulation von PARP- Proteinen mittels RNA Interferenz (RNAi) in Zellkulturen ermöglicht. Die Bedingungen für ein effizientes Gen Silencing wurden zunächst für PARP-1 ermittelt. Die Verminderung der PARP-1 Proteinmenge in Fibroblasten von der Maus wurde mittels zweier unterschiedlicher Techniken getestet. Die erste Methode basiert auf der Verwendung von DNA Plasmiden, die die siRNA Moleküle in den Zellen exprimieren, die zweite Methode auf der direkten Transfektion von in vitro hergestellter siRNA. Die zweite Methode ergab die besseren Ergebnisse. Es wurden sechs siRNAs Sequenzen von PARP- 1 auf ihr Silencing Vermögen hin untersucht. Immunoblot Analysen zeigten, dass die unterschiedlichen siRNA Moleküle in der Lage waren, die PARP-1 Expression von 35 % bis mehr als 98 % der ursprünglichen Level zu reduzieren. Der Effekt wurde nach 24 Stunden sichtbar und hielt bis mindestens 72 Stunden nach der Transfection an. Das Silencing von PARP-1zeigte unter normalen Wachstumsbedingungen keinen offensichtlichen Phenotyp; jedoch waren die mit siRNA behandelten Zellen resistenter gegenüber oxidativem Stress als die Wildtyp Zellen. Die vorliegende Studie zeigt die notwendigen Bedingungen für ein effizientes Silencing von PARP-1 in Zellkulturen; diese Methode wird die Basis für weitere Untersuchungen sein, die letztendlich zur Identifikation der Funktion von PARP-1, und mehr allgemein, zur Funktion der Poly(ADP-Ribose) Synthese, als Antwort auf DNA Schäden, führen.

Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) are enzymes that catalyze the synthesis of ADP-ribose polymers, covalently bound to acceptor proteins and play important roles in various cellular functions. This thesis work was aimed at setting up conditions for specific silencing of individual PARPs in living cells using RNA interference (RNAi). To knock-down PARP-1, the most abundant member of the PARP family, in mouse embryonic fibroblasts (MEFs), two approaches out of the various techniques for RNAi were tested. One approach involved the use of DNA plasmids which express siRNA within the cells and the second approach was based on the direct transfection of in vitro transcribed siRNAs. IThe latter approach gave the best results. Six different PARP-1 targenting siRNAs were tested for their ability to downregulate PARP-1 expression. Immunoblotting analyses revealed that siRNA molecules, targeting different positions on PARP-1 mRNA, were able to reduce PARP-1 expression from 35 % to more than 98 % of basal levels within 24 hours and that the silencing effect persists at least up to 72 hours after transfection. Post-transcriptional silencing of PARP-1 by RNAi did not cause any obvious phenotype under normal growth conditions; however, silenced cells appeared to be more resistant against oxidative stress than wild-type cells. In conclusion, these studies establish conditions for effective PARP-1 silencing in cultured cells; this will provide an essential background for further investigations on the role of PARP-1 and, more generally, of poly (ADP-ribose) synthesis, in the response to DNA damage.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Althaus Felix R, Hofmann-Lehmann Regina
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2004
Deposited On:23 May 2019 14:10
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:75
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod004883502&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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