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Selection of binders and inhibitors from designed ankyrin repeat protein libraries


Amstutz, Patrick. Selection of binders and inhibitors from designed ankyrin repeat protein libraries. 2005, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Antikörper sind unersetzliche Bindemoleküle in der Forschung, der Diagnose und der Therapie. Trotzdem sind Antikörper mit verschiedenen Problemen behaftet, so wie teure Produktion und limitierte Stabilität, vor allem in der Zelle. Deshalb wären bessere Moleküle von grossem Wert. Diese Arbeit beschreibt die erste erfolgreiche Selektion von Bindemolekülen und Inhibitoren aus "Designed Ankyrin Repeat Protein" (DARPin) Bibliotheken. DARPins verbinden hochaffines und hochspezifisches Binden, mit guter Expression und hoher Stabilität, auch unter reduzierenden Bedingungen. Die Selektionen von Bindern wurden mittels "Ribosome Display" bewerkstelligt. Diese in vitro Selektionstechnologie ist ideal um aus Proteinbibliotheken Binder zu selektionieren. Eine Vielzahl von Zielmolekülen wurde für die Selektion gewählt, unter anderem Maltose-binde-Protein (MBP) von Escherichia coli (E. coli), aminoglycoside phosphotransferase (APH), die eukaryotischen protein kinasen p38, JNK1, JNK2 und AMPK und Sec YEG, ein Membranprotein aus E. coli, verantwortlich für den Proteinexport. Gegen sämtliche dieser Zielmoleküle wurden spezifische Binder generiert, was die Qualität der DARPin Proteinbibliothek unterstreicht. Der nächste Schritt war die Demonstration der intrazellulären Funktionalität der DARPins. Zu diesem Zweck wurde APH als Zielmolekül ausgewählt. APH ist eine bakterielle Kinase, die pathogenen Bakterien Kanamycin Resistenz vermittelt. Die potentesten Inhibitoren erwirkten beim Bakterium einen Phänotyp, wie er bei Abwesenheit des APH Gens auftritt. Die Struktur eines Inhibitors zeigt, dass der DARPin eine nicht aktive Konformation des Enzyms stabilisiert. Diese Resultate zeigen klar auf, dass es uns gelungen ist eine vielversprechende Alternative zu Antikörpern zu generieren, welche diese in wichtigen Punkten sogar übertrifft.

Antibodies are indispensable binding molecules in research, diagnostics and therapy. Nevertheless, antibodies are afflicted with problems, such as poor expression and limited stability, especially in the intracellular milieu. Thus, superior alternatives would be of great value. This thesis describes the first successful selections of binding molecules and inhibitors from designed ankyrin repeat protein (DARPin) libraries. DARPins combine high affinity and specificity in target binding with high expression levels and high stabilities in all conditions. The selections of DARPins binding to the given target proteins were achieved by ribosome display, an in vitro selection technology, ideally suited to identify or evolve binding molecules from combinatorial protein libraries. Several different target proteins were chosen, including maltose binding protein (MBP) of Escherichia coli (E. coli), aminoglycoside phosphotransferase (APH), the eukaryotic protein kinases p38, JNK1, JNK2 and AMPK and Sec YEG, a membrane protein of E. coli responsible for protein export. Against these target proteins, specific binding molecules were obtained, demonstrating the power of DARPin libraries. The intracellular functionality of DARPins was demonstrated by the selection of inhibitors against APH. APH is a bacterial kinase and mediates kanamycin resistance in different pathogenic bacteria. The most potent of the selected inhibitors mediated a phenotype comparable to the APH gene knock out. The structure of the inhibitor in complex with APH showed that the DARPin bound and stabilized the kinase in an unproductive conformation, thus causing inhibition. In conclusion, this thesis demonstrates that DARPins are a true alternative to antibodies, surpassing them in several biophysical properties.

Abstract

Antikörper sind unersetzliche Bindemoleküle in der Forschung, der Diagnose und der Therapie. Trotzdem sind Antikörper mit verschiedenen Problemen behaftet, so wie teure Produktion und limitierte Stabilität, vor allem in der Zelle. Deshalb wären bessere Moleküle von grossem Wert. Diese Arbeit beschreibt die erste erfolgreiche Selektion von Bindemolekülen und Inhibitoren aus "Designed Ankyrin Repeat Protein" (DARPin) Bibliotheken. DARPins verbinden hochaffines und hochspezifisches Binden, mit guter Expression und hoher Stabilität, auch unter reduzierenden Bedingungen. Die Selektionen von Bindern wurden mittels "Ribosome Display" bewerkstelligt. Diese in vitro Selektionstechnologie ist ideal um aus Proteinbibliotheken Binder zu selektionieren. Eine Vielzahl von Zielmolekülen wurde für die Selektion gewählt, unter anderem Maltose-binde-Protein (MBP) von Escherichia coli (E. coli), aminoglycoside phosphotransferase (APH), die eukaryotischen protein kinasen p38, JNK1, JNK2 und AMPK und Sec YEG, ein Membranprotein aus E. coli, verantwortlich für den Proteinexport. Gegen sämtliche dieser Zielmoleküle wurden spezifische Binder generiert, was die Qualität der DARPin Proteinbibliothek unterstreicht. Der nächste Schritt war die Demonstration der intrazellulären Funktionalität der DARPins. Zu diesem Zweck wurde APH als Zielmolekül ausgewählt. APH ist eine bakterielle Kinase, die pathogenen Bakterien Kanamycin Resistenz vermittelt. Die potentesten Inhibitoren erwirkten beim Bakterium einen Phänotyp, wie er bei Abwesenheit des APH Gens auftritt. Die Struktur eines Inhibitors zeigt, dass der DARPin eine nicht aktive Konformation des Enzyms stabilisiert. Diese Resultate zeigen klar auf, dass es uns gelungen ist eine vielversprechende Alternative zu Antikörpern zu generieren, welche diese in wichtigen Punkten sogar übertrifft.

Antibodies are indispensable binding molecules in research, diagnostics and therapy. Nevertheless, antibodies are afflicted with problems, such as poor expression and limited stability, especially in the intracellular milieu. Thus, superior alternatives would be of great value. This thesis describes the first successful selections of binding molecules and inhibitors from designed ankyrin repeat protein (DARPin) libraries. DARPins combine high affinity and specificity in target binding with high expression levels and high stabilities in all conditions. The selections of DARPins binding to the given target proteins were achieved by ribosome display, an in vitro selection technology, ideally suited to identify or evolve binding molecules from combinatorial protein libraries. Several different target proteins were chosen, including maltose binding protein (MBP) of Escherichia coli (E. coli), aminoglycoside phosphotransferase (APH), the eukaryotic protein kinases p38, JNK1, JNK2 and AMPK and Sec YEG, a membrane protein of E. coli responsible for protein export. Against these target proteins, specific binding molecules were obtained, demonstrating the power of DARPin libraries. The intracellular functionality of DARPins was demonstrated by the selection of inhibitors against APH. APH is a bacterial kinase and mediates kanamycin resistance in different pathogenic bacteria. The most potent of the selected inhibitors mediated a phenotype comparable to the APH gene knock out. The structure of the inhibitor in complex with APH showed that the DARPin bound and stabilized the kinase in an unproductive conformation, thus causing inhibition. In conclusion, this thesis demonstrates that DARPins are a true alternative to antibodies, surpassing them in several biophysical properties.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Plückthun Andreas, Hilvert Donald
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2005
Deposited On:05 Jun 2019 12:50
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:165
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005059626&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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