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Insulin signaling and growth control in Drosophila melanogaster


Stocker, Hugo. Insulin signaling and growth control in Drosophila melanogaster. 2004, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Obwohl die Grössenzunahme eine augenfällige Eigenschaft der Entwicklung darstellt, ist über die Mechanismen, welche das Wachstum von Zellen, Geweben und ganzen Organismen steuern, erstaunlich wenig bekannt. Um mehr Licht in die Wachstumskontrolle zu bringen, wurde ein genetischer Ansatz im Modellorganismus Drosophila melanogaster gewählt. Eine Mutagenese verfolgte das Ziel, Gene, deren Produkte wachstumsfördernd oder -hemmend wirken, zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden Mosaiktiere generiert, deren Köpfe grösstenteils homozygot für zufällige Mutationen waren, während die Körper heterozygot blieben. Das Auftreten von unnatürlichen Kopfgrössen erlaubte eine Selektion von Mutationen in Genen, die eine Rolle in der Wachstumskontrolle spielen. Von Fliegen mit kleineren Köpfen (sogenannten Pinheads) kann erwartet werden, dass sie eine wachstumsfördernde Genfunktion beeinträchtigt haben, während grössere Köpfe auf einen Defekt in einem wachstumshemmenden Gen hinweisen. Eine detaillierte Komplementationsanalyse mit den gefundenen Allelen hat gezeigt, dass das Rückgrat des Signaltransduktionswegs des Insulinrezeptors mehrfach getroffen worden ist. Mehrere Allele in den Genen, die für den Insulinrezeptor, für die katalytische Untereinheit der Lipidkinase PI3K sowie für die Serin/Threonin-spezifische Proteinkinase Akt (auch Proteinkinase B genannt) kodieren, wurden aufgrund des resultierenden Pinhead-Phänotyps gefunden. Dies belegt eindrücklich die Wichtigkeit dieses Signaltransduktionswegs in der Wachstumskontrolle. Zusätzlich konnten weitere, teilweise unbekannte Gene identifiziert werden, die einen positiven oder negativen Einfluss auf das Wachstum ausüben. Spezielle Aufmerksamkeit wurde der Charakterisierung eines Gens gewidmet, welches für das Fliegenhomologe der kleinen GTPase Rheb kodiert. Mittels detaillierter Epistasie-Analyse konnte Rheb zweifelsfrei in einem genetischen Netzwerk unterhalb von den Tumorsuppressorgenen Tsc1/2 (Tuberous Sclerosis Complex 1/2) sowie oberhalb von TOR (Target of Rapamycin) und S6K (ribosomale Protein S6 Kinase) eingeordnet werden. Dieser Befund wurde durch biochemische Experimente unterstützt, welche eine Abhängigkeit der S6K-Aktivität von Rheb demonstrieren. In Mittelpunkt des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit steht das Proto-Onkogen Akt. Die Proteinkinase Akt trägt am NH2-terminalen Ende eine Pleckstrin-Homologie (PH) Domäne, welche mit hoher Affinität an Phosphatidylinositole bindet, die an der D3 Position phosphoryliert sind (PI(3,4)P2 und vor allem PI(3,4,5)P3, kurz PIP3). Bei Aktivierung der Signalkaskade steigt die Konzentration des sekundären Botenstoffes PIP3 in der Zellmembran an, wodurch sich Akt an die Membran anlagert, wo es durch zwei folgende Phosphorylierungsschritte aktiviert wird. Durch den Einsatz von neuen Mutationen im Gen, welches für Drosophila Akt kodiert, konnten die phänotypischen Auswirkungen einer verminderten Akt Aktivität während der Entwicklung untersucht werden. Die Ergebnisse von zahlreichen Studien an Zellkulturen von Säugern haben auf eine wichtige anti-apoptotische Funktion von Akt hingewiesen. Deshalb mag es erstaunen, dass der Verlust der Akt Funktion während der Entwicklung von Drosophila keinen programmierten Zelltod auslöst. Vielmehr wachsen die betroffenen Zellen äusserst langsam, und Tiere mit beeinträchtigter Akt Funktion erreichen das Adultstadium mit beträchtlicher Verspätung und weisen eine deutlich reduzierte Körpergrösse auf, die aufgrund von weniger und kleinerern Zellen zustande kommt. Interessanterweise können Fliegen ohne die Funktion des Tumorsuppressorgens PTEN überleben, wenn sie in Akt eine Mutation tragen, welche die Affinität der PH Domäne für PIP3 vermindert. Diese überlebenden Tiere demonstrieren zwei wichtige Befunde: Die Aktivierung der Proteinkinase Akt scheint das einzige kritische Ereignis zu sein, das durch den Funktionsverlust von PTEN bewirkt wird. Und zweitens kann gefolgert werden, dass PTEN keine weiteren Funktionen als die Dephosphorylierung von PIP3 ausübt.

Despite the fact that increase in size is one of the most obvious features of development, relatively little is known about the mechanisms at work to ensure proper growth at the levels of the cell, the tissues and the whole organism. A genetic approach in the model organism Drosophila melanogaster was initiated to shed light on the regulatory network governing growth. To identify genes involved in growth regulation, an unbiased screen for mutations that either stimulate or inhibit growth was performed. The rationale of the screen was to generate mosaic flies consisting of heads largely homozygous for randomly induced mutations on heterozygous bodies. By screening for head size abnormalities in such animals, mutations in genes involved in growth control could be selected for. Flies with heads of reduced size (so-called pinheads) can be expected to carry a lesion in a growth-promoting gene, whereas bigger than normal heads are indicative of loss of a growth-restricting gene function. A detailed complementation analysis with the obtained alleles revealed that the backbone of the signal transduction cascade initiated by the insulin receptor was hit many times. Multiple mutations in the genes encoding the insulin receptor (Inr), the catalytic subunit of the lipid kinase PI3K (Dp110), and the serine-threonine kinase Akt (also called protein kinase B, PKB) were recovered by virtue of the resulting pinhead phenotype, demonstrating the outstanding importance of this signaling pathway in the control of cellular growth. In addition, mutations in a number of novel genes that either promote or dampen growth were identified. Special emphasis was put on the characterization of the gene encoding the Drosophila homolog of the small GTPase Rheb (Ras homolog enriched in brain). By means of a detailed epistasis analysis, Rheb could be unequivocally placed downstream of the tumor suppressor genes Tsc1/Tsc2 (Tuberous Sclerosis Complex 1/2) and upstream of TOR (target of Rapamycin) and S6K (ribosomal protein S6 kinase), a finding that was further substantiated by the biochemical demonstration that the activity of S6K critically depends on Rheb. A second part of this thesis deals specifically with the role of a key component of the insulin receptor signaling pathway, the proto-oncogene Akt (or PKB). Akt is a serine- threonine protein kinase carrying an NH2-terminally located pleckstrin homology (PH) domain that binds with high affinity to D3-phosphorylated phosphatidylinositols (PI(3,4) P2 and PI(3,4,5)P3). Upon signaling activity, the concentration of the second messenger PIP3 in the plasma membrane raises, thereby recruiting Akt to the membrane where it is activated by two subsequent phosphorylation steps. Using novel protein variants, the phenotypic consequences of impaired Akt function during Drosophila development were investigated. Whereas numerous studies of Akt function in mammalian cell culture systems have implicated this kinase as a key player in the protection from apoptosis, loss of Drosophila Akt function did not trigger programmed cell death. Cells devoid of Akt function rather grew very slowly, and animals with reduced Akt function emerged with a substantial delay and displayed dramatically reduced body size due to fewer and smaller cells. Most importantly, animals completely lacking the tumor suppressor PTEN were rescued by a mutation in Akt that specifically lowers the affinity of its PH domain for PIP3. Two lessons can be learnt from these rather unexpected survivors. First, activation of Akt is the critical event caused by the loss of PTEN function. Second, the only essential function that PTEN performs is to dephosphorylate PIP3.

Abstract

Obwohl die Grössenzunahme eine augenfällige Eigenschaft der Entwicklung darstellt, ist über die Mechanismen, welche das Wachstum von Zellen, Geweben und ganzen Organismen steuern, erstaunlich wenig bekannt. Um mehr Licht in die Wachstumskontrolle zu bringen, wurde ein genetischer Ansatz im Modellorganismus Drosophila melanogaster gewählt. Eine Mutagenese verfolgte das Ziel, Gene, deren Produkte wachstumsfördernd oder -hemmend wirken, zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden Mosaiktiere generiert, deren Köpfe grösstenteils homozygot für zufällige Mutationen waren, während die Körper heterozygot blieben. Das Auftreten von unnatürlichen Kopfgrössen erlaubte eine Selektion von Mutationen in Genen, die eine Rolle in der Wachstumskontrolle spielen. Von Fliegen mit kleineren Köpfen (sogenannten Pinheads) kann erwartet werden, dass sie eine wachstumsfördernde Genfunktion beeinträchtigt haben, während grössere Köpfe auf einen Defekt in einem wachstumshemmenden Gen hinweisen. Eine detaillierte Komplementationsanalyse mit den gefundenen Allelen hat gezeigt, dass das Rückgrat des Signaltransduktionswegs des Insulinrezeptors mehrfach getroffen worden ist. Mehrere Allele in den Genen, die für den Insulinrezeptor, für die katalytische Untereinheit der Lipidkinase PI3K sowie für die Serin/Threonin-spezifische Proteinkinase Akt (auch Proteinkinase B genannt) kodieren, wurden aufgrund des resultierenden Pinhead-Phänotyps gefunden. Dies belegt eindrücklich die Wichtigkeit dieses Signaltransduktionswegs in der Wachstumskontrolle. Zusätzlich konnten weitere, teilweise unbekannte Gene identifiziert werden, die einen positiven oder negativen Einfluss auf das Wachstum ausüben. Spezielle Aufmerksamkeit wurde der Charakterisierung eines Gens gewidmet, welches für das Fliegenhomologe der kleinen GTPase Rheb kodiert. Mittels detaillierter Epistasie-Analyse konnte Rheb zweifelsfrei in einem genetischen Netzwerk unterhalb von den Tumorsuppressorgenen Tsc1/2 (Tuberous Sclerosis Complex 1/2) sowie oberhalb von TOR (Target of Rapamycin) und S6K (ribosomale Protein S6 Kinase) eingeordnet werden. Dieser Befund wurde durch biochemische Experimente unterstützt, welche eine Abhängigkeit der S6K-Aktivität von Rheb demonstrieren. In Mittelpunkt des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit steht das Proto-Onkogen Akt. Die Proteinkinase Akt trägt am NH2-terminalen Ende eine Pleckstrin-Homologie (PH) Domäne, welche mit hoher Affinität an Phosphatidylinositole bindet, die an der D3 Position phosphoryliert sind (PI(3,4)P2 und vor allem PI(3,4,5)P3, kurz PIP3). Bei Aktivierung der Signalkaskade steigt die Konzentration des sekundären Botenstoffes PIP3 in der Zellmembran an, wodurch sich Akt an die Membran anlagert, wo es durch zwei folgende Phosphorylierungsschritte aktiviert wird. Durch den Einsatz von neuen Mutationen im Gen, welches für Drosophila Akt kodiert, konnten die phänotypischen Auswirkungen einer verminderten Akt Aktivität während der Entwicklung untersucht werden. Die Ergebnisse von zahlreichen Studien an Zellkulturen von Säugern haben auf eine wichtige anti-apoptotische Funktion von Akt hingewiesen. Deshalb mag es erstaunen, dass der Verlust der Akt Funktion während der Entwicklung von Drosophila keinen programmierten Zelltod auslöst. Vielmehr wachsen die betroffenen Zellen äusserst langsam, und Tiere mit beeinträchtigter Akt Funktion erreichen das Adultstadium mit beträchtlicher Verspätung und weisen eine deutlich reduzierte Körpergrösse auf, die aufgrund von weniger und kleinerern Zellen zustande kommt. Interessanterweise können Fliegen ohne die Funktion des Tumorsuppressorgens PTEN überleben, wenn sie in Akt eine Mutation tragen, welche die Affinität der PH Domäne für PIP3 vermindert. Diese überlebenden Tiere demonstrieren zwei wichtige Befunde: Die Aktivierung der Proteinkinase Akt scheint das einzige kritische Ereignis zu sein, das durch den Funktionsverlust von PTEN bewirkt wird. Und zweitens kann gefolgert werden, dass PTEN keine weiteren Funktionen als die Dephosphorylierung von PIP3 ausübt.

Despite the fact that increase in size is one of the most obvious features of development, relatively little is known about the mechanisms at work to ensure proper growth at the levels of the cell, the tissues and the whole organism. A genetic approach in the model organism Drosophila melanogaster was initiated to shed light on the regulatory network governing growth. To identify genes involved in growth regulation, an unbiased screen for mutations that either stimulate or inhibit growth was performed. The rationale of the screen was to generate mosaic flies consisting of heads largely homozygous for randomly induced mutations on heterozygous bodies. By screening for head size abnormalities in such animals, mutations in genes involved in growth control could be selected for. Flies with heads of reduced size (so-called pinheads) can be expected to carry a lesion in a growth-promoting gene, whereas bigger than normal heads are indicative of loss of a growth-restricting gene function. A detailed complementation analysis with the obtained alleles revealed that the backbone of the signal transduction cascade initiated by the insulin receptor was hit many times. Multiple mutations in the genes encoding the insulin receptor (Inr), the catalytic subunit of the lipid kinase PI3K (Dp110), and the serine-threonine kinase Akt (also called protein kinase B, PKB) were recovered by virtue of the resulting pinhead phenotype, demonstrating the outstanding importance of this signaling pathway in the control of cellular growth. In addition, mutations in a number of novel genes that either promote or dampen growth were identified. Special emphasis was put on the characterization of the gene encoding the Drosophila homolog of the small GTPase Rheb (Ras homolog enriched in brain). By means of a detailed epistasis analysis, Rheb could be unequivocally placed downstream of the tumor suppressor genes Tsc1/Tsc2 (Tuberous Sclerosis Complex 1/2) and upstream of TOR (target of Rapamycin) and S6K (ribosomal protein S6 kinase), a finding that was further substantiated by the biochemical demonstration that the activity of S6K critically depends on Rheb. A second part of this thesis deals specifically with the role of a key component of the insulin receptor signaling pathway, the proto-oncogene Akt (or PKB). Akt is a serine- threonine protein kinase carrying an NH2-terminally located pleckstrin homology (PH) domain that binds with high affinity to D3-phosphorylated phosphatidylinositols (PI(3,4) P2 and PI(3,4,5)P3). Upon signaling activity, the concentration of the second messenger PIP3 in the plasma membrane raises, thereby recruiting Akt to the membrane where it is activated by two subsequent phosphorylation steps. Using novel protein variants, the phenotypic consequences of impaired Akt function during Drosophila development were investigated. Whereas numerous studies of Akt function in mammalian cell culture systems have implicated this kinase as a key player in the protection from apoptosis, loss of Drosophila Akt function did not trigger programmed cell death. Cells devoid of Akt function rather grew very slowly, and animals with reduced Akt function emerged with a substantial delay and displayed dramatically reduced body size due to fewer and smaller cells. Most importantly, animals completely lacking the tumor suppressor PTEN were rescued by a mutation in Akt that specifically lowers the affinity of its PH domain for PIP3. Two lessons can be learnt from these rather unexpected survivors. First, activation of Akt is the critical event caused by the loss of PTEN function. Second, the only essential function that PTEN performs is to dephosphorylate PIP3.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hafen Ernst, Gallant Peter
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2004
Deposited On:05 Jun 2019 13:39
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:77
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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