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Filamentous phage infection of E. coli : mechanistic aspects and applications to in vitro protein evolution


Mooser, Alexandre. Filamentous phage infection of E. coli : mechanistic aspects and applications to in vitro protein evolution. 2005, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Die vorliegende Arbeit ist in ihrem ersten Teil der ausführlichen Untersuchung der strukturellen Prozesse gewidmet, die die bakterielle Infektion durch filamentöse Bakteriophagen regeln. In einem zweiten Teil wird der Gebrauch der filamentösen Bakteriophagen als Werkzeug beschrieben, um die Bindungseigenschaft eines Antikörperfragments zu verbessern. Der erste Abschnitt, betitelt "Biology and structure of filamentous bacteriophages", soll dem Leser einen allgemeinen Überblick über die Biologie der filamentösen Bakteriophagen und des Bakteriums geben. Im zweiten Abschnitt wird die Untersuchung und biochemische Charakterisierung zweier Proteine beschrieben, von denen man annimmt, dass sie im Infektionsprozeß von Escherichia coli durch filamentöse Bakteriophagen involviert sind. Das Hüllprotein pIII ist im Detail untersucht worden; seine biochemische Charakterisierung führte uns zum Ergebnis, dass pIII in gelöster Form an sich instabil ist. Das folgende Kapitel dieses Abschnitts wird dem TolQRA Komplex und insbesondere einem seiner Mitglieder gewidmet. Das in der inneren Membran verankerte TolR ist bekannt für seine ausschlaggebende Rolle in Bakteriophageninfektion. Schließlich wird ein Kapitel dem topologisch verwandten ExbB-ExbD-TonB Komplex gewidmet. Durch die Definition und erfolgreiche Expression und Kristallisation der gefalteten Domäne des TonB konnte dessen Kristallstruktur bestimmt werden. Unsere veröffentliche Kristallstruktur der C- terminalen Domäne von TonB bildet die Grundlage einer kritischen Diskussion über die Transportmechanismen von Colicinen in E. coli. Der dritte Abschnitt zeigt den Nutzen von Bakteriophagen in einem modernen biotechnologischen Prozess. Die Anwendung der "Phage Display" wird durch die Affinitätsmaturierung eines Antikörperfragments veranschaulicht, das gegen einen Membranproteinkomplex von immunologischen Bedeutung gerichtet ist. Indem wir "Phage Display" und neue Antikörpermethoden kombinierten, versuchten wir, die Dissoziationskonstante eines Fab Antikörperfragments spezifisch für den MHC-gp33 Peptidkomplex zu verbessern. Unsere Ergebnisse werden im Hinblick auf neue Protein- Evolutionsstudien interpretiert, die sich mit Proteinplastizität und ihrer Toleranz gegen Aminosäureveränderungen befassen.

The present work is dedicated, in its first part, to the detailed study of the structural processes governing bacterial infection by filamentous phage. In a second part, I illustrate the use of filamentous phage as a tool to improve the binding property of an antibody fragment. The first section, entitled "Biology and structure of filamentous bacteriophages", is intended to give the reader a general overview of the biology of filamentous phages and bacteria. In the second section, two proteins which are intricately implicated in the infection process of Escherichia coli by filamentous bacteriophages have been investigated and, to some extent, biochemically characterized. The minor coat protein pIII has been extensively studied; its biochemical characterization led us to the conclusion that pIII is intrinsically unstable in solution. The next chapter of this section is devoted to the TolQRA complex, and in particular to the inner membrane-anchored TolR, known to be critical for phage entry. Finally, the topologically related ExbB-ExbD-TonB complex was investigated. Using a prediction-based method to define the folded domain of TonB, a crystal structure could be obtained. Our published crystal structure of the C-terminal domain of TonB forms the basis of a critical discussion about the transport mechanism of colicins into E. coli. The third section demonstrates the usefulness of bacteriophages in a modern biotechnological application. It is illustrated by the affinity maturation of an antibody fragment directed against a mammalian membrane protein complex of immunological relevance. By combining phage display and structure-based antibody engineering methods, we tried to improve the dissociation constant of a Fab antibody fragment specific for the MHC-gp33 peptide complex. An interpretation of our results is given in view of recent protein evolution studies dealing with protein plasticity and their tolerance to amino acids mutations.

Abstract

Die vorliegende Arbeit ist in ihrem ersten Teil der ausführlichen Untersuchung der strukturellen Prozesse gewidmet, die die bakterielle Infektion durch filamentöse Bakteriophagen regeln. In einem zweiten Teil wird der Gebrauch der filamentösen Bakteriophagen als Werkzeug beschrieben, um die Bindungseigenschaft eines Antikörperfragments zu verbessern. Der erste Abschnitt, betitelt "Biology and structure of filamentous bacteriophages", soll dem Leser einen allgemeinen Überblick über die Biologie der filamentösen Bakteriophagen und des Bakteriums geben. Im zweiten Abschnitt wird die Untersuchung und biochemische Charakterisierung zweier Proteine beschrieben, von denen man annimmt, dass sie im Infektionsprozeß von Escherichia coli durch filamentöse Bakteriophagen involviert sind. Das Hüllprotein pIII ist im Detail untersucht worden; seine biochemische Charakterisierung führte uns zum Ergebnis, dass pIII in gelöster Form an sich instabil ist. Das folgende Kapitel dieses Abschnitts wird dem TolQRA Komplex und insbesondere einem seiner Mitglieder gewidmet. Das in der inneren Membran verankerte TolR ist bekannt für seine ausschlaggebende Rolle in Bakteriophageninfektion. Schließlich wird ein Kapitel dem topologisch verwandten ExbB-ExbD-TonB Komplex gewidmet. Durch die Definition und erfolgreiche Expression und Kristallisation der gefalteten Domäne des TonB konnte dessen Kristallstruktur bestimmt werden. Unsere veröffentliche Kristallstruktur der C- terminalen Domäne von TonB bildet die Grundlage einer kritischen Diskussion über die Transportmechanismen von Colicinen in E. coli. Der dritte Abschnitt zeigt den Nutzen von Bakteriophagen in einem modernen biotechnologischen Prozess. Die Anwendung der "Phage Display" wird durch die Affinitätsmaturierung eines Antikörperfragments veranschaulicht, das gegen einen Membranproteinkomplex von immunologischen Bedeutung gerichtet ist. Indem wir "Phage Display" und neue Antikörpermethoden kombinierten, versuchten wir, die Dissoziationskonstante eines Fab Antikörperfragments spezifisch für den MHC-gp33 Peptidkomplex zu verbessern. Unsere Ergebnisse werden im Hinblick auf neue Protein- Evolutionsstudien interpretiert, die sich mit Proteinplastizität und ihrer Toleranz gegen Aminosäureveränderungen befassen.

The present work is dedicated, in its first part, to the detailed study of the structural processes governing bacterial infection by filamentous phage. In a second part, I illustrate the use of filamentous phage as a tool to improve the binding property of an antibody fragment. The first section, entitled "Biology and structure of filamentous bacteriophages", is intended to give the reader a general overview of the biology of filamentous phages and bacteria. In the second section, two proteins which are intricately implicated in the infection process of Escherichia coli by filamentous bacteriophages have been investigated and, to some extent, biochemically characterized. The minor coat protein pIII has been extensively studied; its biochemical characterization led us to the conclusion that pIII is intrinsically unstable in solution. The next chapter of this section is devoted to the TolQRA complex, and in particular to the inner membrane-anchored TolR, known to be critical for phage entry. Finally, the topologically related ExbB-ExbD-TonB complex was investigated. Using a prediction-based method to define the folded domain of TonB, a crystal structure could be obtained. Our published crystal structure of the C-terminal domain of TonB forms the basis of a critical discussion about the transport mechanism of colicins into E. coli. The third section demonstrates the usefulness of bacteriophages in a modern biotechnological application. It is illustrated by the affinity maturation of an antibody fragment directed against a mammalian membrane protein complex of immunological relevance. By combining phage display and structure-based antibody engineering methods, we tried to improve the dissociation constant of a Fab antibody fragment specific for the MHC-gp33 peptide complex. An interpretation of our results is given in view of recent protein evolution studies dealing with protein plasticity and their tolerance to amino acids mutations.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Plückthun Andreas, Bosshard Hans Rudolf
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2005
Deposited On:05 Jun 2019 14:27
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:113
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005127414&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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