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Regulation of the sodium-proton-exchanger NHE3 and the sodium-phosphate-cotransporter NaPi-IIa by PKA and EPAC


Honegger, Katharina Juliana. Regulation of the sodium-proton-exchanger NHE3 and the sodium-phosphate-cotransporter NaPi-IIa by PKA and EPAC. 2006, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Der Typ IIa Natrium-abhängige Phosphatkotransporter (NaPi-IIa; SLC34A1) wird in der Bürstensaummembran der proximalen Tubuluszellen in der Niere exprimiert, wo der grösste Teil der Reabsorption von Phosphat aus dem Primärharn stattfindet. Der Natrium-Protonen-Austauscher 3 (NHE3, SLC9A3) ist ebenfalls in der Bürstensaummembran der proximalen Tubuluszellen lokalisiert und spielt eine wichtige Rolle im Säure/Base-Haushalt und in der Regulierung des extrazellulären Volumens. Sowohl NaPi-IIa als auch NHE3 werden über das Parathormon (PTH) und Dopamin (DA) reguliert. Beide Hormone induzieren die Internalisierung von NaPi-IIa, welches anschliessend in Lysosomen degradiert wird. Im Gegensatz dazu wird die Aktivität von NHE3 zunächst inhibiert, während die Expression in der Membran gleich bleibt. PTH- und DA-Rezeptoren gehören zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren und leiten Signale über die Aktivierung der Adenylatzyklase (AC) und der Phospholipase C (PLC) weiter. Die Aktivierung der AC und der dadurch ausgelöste Anstieg von intrazellulärem cAMP spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von NaPi- IIa und NHE3. Da durch intrazelluläres cAMP zwei unabhängige Signalwege aktiviert werden: Die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) und das durch cAMP direkt aktivierte Guanin-Austauscher-Protein (EPAC). Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der PKA- und EPAC-abhängigen Signalkaskaden und deren Rolle in der Regulierung von NaPi-IIa und NHE3. Zu diesem Zweck wurden verschieden modifizierte cAMP-Analoge verwendet, welche entweder PKA oder EPAC aktivieren. Die Aktivität von NaPi-IIa und NHE3 wurde in Gegenwart und Abwesenheit dieser modifizierten cAMP untersucht. Die Experimente wurden in kultivierten Opossumnierenzellen (OK-Zellen) und in Mausnierenschnitten durchgeführt. OK-Zellen exprimieren endogen NaPi-IIa- und NHE3-Proteine, welche vollständig in der Membran lokalisiert (apikal) sind und reguliert werden. Andererseits hat unser Labor gezeigt, dass Mausnierenschnitte die morphologischen und funktionalen Eigenschaften innerhalb des Zeitfensters, in welchem die verschiedenen modifizierten cAMP-Analoge untersucht wurden, beibehielten. Die Aktivität von NHE3 wurde mittels Messung der Aenderung der Na+-abhängigen intrazellulären Alkalisierungsrate in OK-Zellen bestimmt. In Bürstensaummembranvesikeln (isoliert aus Mausnierenschnitten) wurde die Aktivität von NHE3 mittels Acridin-orange- Fluorimetrie ermittelt. Die Aktivität von NaPi-IIa wurde durch Messung der Na+- abhängigen 32P-Aufnahme bestimmt. Die Aktivierung des PKA- oder EPAC-Signalweges resultierte sowohl in OK-Zellen als auch in Nierenschnitten in einer Inhibition der NHE3-Aktivität. Durch direkte und indirekte Messungen der PKA-Aktivität wurde gezeigt, dass der durch EPAC induzierte Effekt unabhängig von der PKA-Aktivierung war. Desweiteren waren die Effekte von PKA und EPAC unabhängig von Phospholipase C (PLC) Aktivierung, da die PLC-Aktivität durch keinen der beiden Aktivatoren (PKA und EPAC) beeinflusst wurde. Dennoch waren sowohl die PKA- als auch die EPAC-induzierte Inhibition von NHE3 sensitiv gegenüber einem MEK1/2-spezifischen Inhibitor. Dies impliziert eine Rolle von ERK1/2 in diesem Prozess. Sowohl PKA als auch EPAC inhibierten die Aktivität von NHE3, ohne dass sich die Expression des Transporters in der Membran änderte. Andererseits führte PKA-Aktivierung, aber nicht EPAC-Aktivierung, zur Inhibition der NaPi-IIa-Aktivität in OK-Zellen. Diese Inhibition erfolgte über Endozytose. Zusammenfassend deuten diese Resultate darauf hin, dass die Aktivierung von EPAC einen neuen Mechanismus darstellt, der an der Regulierung von NHE3 beteiligt ist. Die Regulierung von NaPi-IIa ist hingegen nur über PKA gesteuert.

The type IIa Na/Pi-cotransporter (NaPi-lla; SLC34A1) is expressed in the brush border membrane (BBM) of renal proximal tubules where it mediates the bulk of Pi reabsorption from the primary urine. The Na/H-exchanger 3 (NHE3; SLC9A3) is also expressed in the BBM of proximal tubules and plays a major role in acid-base and extracellular volume regulation. Both NaPi-IIa and NHE3 are regulated by parathyroid hormone (PTH) and dopamine (DA). In the case of NaPi-IIa, both hormones induce membrane retrieval and lysosomal degradation. In contrast, NHE3 activity is inhibited in an early phase without reduction of the transporter expression in the BBM. PTH and DA receptors belong to the superfamily of G-protein coupled receptors (GPCR) and signal via activation of adenylyl cyclase (AC) and phospholipase C (PLC). Activation of AC with the subsequent increase in intracellular cAMP plays a key role in the regulation of both NaPi-IIa and NHE3. Intracellular cAMP signals through two independent pathways: the cAMP-dependent protein kinase A (PKA) and the guanine exchange protein directly activated by cAMP (EPAC). The aim of this study was to investigate the contribution of the PKA- and the EPAC- dependent pathways in the regulation of NaPi-IIa and NHE3. For that purpose, the activity of NaPi-IIa and NHE3 was determined in the absence/presence of several cAMP analogs which preferentially activate either the PKA or EPAC pathway. Studies were performed in Opossum kidney (OK) cells and in slices from mouse kidney. OK cells express endogenous NHE3 and NaPi-IIa transporters that are properly (apically) expressed and regulated. On the other hand, our lab has shown that slices from mouse kidney retain their morphological and functional properties within the time frame in which the effects of the different analogs were investigated. NHE3 activity was determined in OK cells by measurements of Na+-dependent intracellular pH recovery rates, and in BBMV (isolated from slices of mouse kidney) by acridine-orange fluorimetry. NaPi-IIa activity was determined in OK cells by measurement of Na+- dependent 32P-uptake. Activation of either the PKA or EPAC pathway resulted in inhibition of NHE3 activity, both in OK cells and kidney slices. The EPAC-induced effect was independent of PKA activation, as indicated by direct and indirect measurements of PKA activity. The PKA and EPAC effects were independent of activation of phospholipase C (PLC), as PLC activity was affected by neither activator. However, the PKA- as well as the EPAC- induced inhibition of NHE3 was sensitive to a MEK1/2-specific inhibitor, suggesting the implication of ERK1/2 in that process. Both PKA and EPAC inhibited NHE3 activity without inducing changes in the expression of the transporter in the BBM, suggesting that inhibition may involve modification of surface expressed transporters. On another hand, activation of PKA, but not of EPAC, inhibited NaPi-lla activity in OK cells. The PKA-induced inhibition was mediated by endocytosis. In summary, these results suggest that EPAC activation may represent a novel mechanism involved in the cAMP regulation of NHE3, whereas regulation of NaPi-lla is mediated by PKA only.

Abstract

Der Typ IIa Natrium-abhängige Phosphatkotransporter (NaPi-IIa; SLC34A1) wird in der Bürstensaummembran der proximalen Tubuluszellen in der Niere exprimiert, wo der grösste Teil der Reabsorption von Phosphat aus dem Primärharn stattfindet. Der Natrium-Protonen-Austauscher 3 (NHE3, SLC9A3) ist ebenfalls in der Bürstensaummembran der proximalen Tubuluszellen lokalisiert und spielt eine wichtige Rolle im Säure/Base-Haushalt und in der Regulierung des extrazellulären Volumens. Sowohl NaPi-IIa als auch NHE3 werden über das Parathormon (PTH) und Dopamin (DA) reguliert. Beide Hormone induzieren die Internalisierung von NaPi-IIa, welches anschliessend in Lysosomen degradiert wird. Im Gegensatz dazu wird die Aktivität von NHE3 zunächst inhibiert, während die Expression in der Membran gleich bleibt. PTH- und DA-Rezeptoren gehören zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren und leiten Signale über die Aktivierung der Adenylatzyklase (AC) und der Phospholipase C (PLC) weiter. Die Aktivierung der AC und der dadurch ausgelöste Anstieg von intrazellulärem cAMP spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von NaPi- IIa und NHE3. Da durch intrazelluläres cAMP zwei unabhängige Signalwege aktiviert werden: Die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) und das durch cAMP direkt aktivierte Guanin-Austauscher-Protein (EPAC). Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der PKA- und EPAC-abhängigen Signalkaskaden und deren Rolle in der Regulierung von NaPi-IIa und NHE3. Zu diesem Zweck wurden verschieden modifizierte cAMP-Analoge verwendet, welche entweder PKA oder EPAC aktivieren. Die Aktivität von NaPi-IIa und NHE3 wurde in Gegenwart und Abwesenheit dieser modifizierten cAMP untersucht. Die Experimente wurden in kultivierten Opossumnierenzellen (OK-Zellen) und in Mausnierenschnitten durchgeführt. OK-Zellen exprimieren endogen NaPi-IIa- und NHE3-Proteine, welche vollständig in der Membran lokalisiert (apikal) sind und reguliert werden. Andererseits hat unser Labor gezeigt, dass Mausnierenschnitte die morphologischen und funktionalen Eigenschaften innerhalb des Zeitfensters, in welchem die verschiedenen modifizierten cAMP-Analoge untersucht wurden, beibehielten. Die Aktivität von NHE3 wurde mittels Messung der Aenderung der Na+-abhängigen intrazellulären Alkalisierungsrate in OK-Zellen bestimmt. In Bürstensaummembranvesikeln (isoliert aus Mausnierenschnitten) wurde die Aktivität von NHE3 mittels Acridin-orange- Fluorimetrie ermittelt. Die Aktivität von NaPi-IIa wurde durch Messung der Na+- abhängigen 32P-Aufnahme bestimmt. Die Aktivierung des PKA- oder EPAC-Signalweges resultierte sowohl in OK-Zellen als auch in Nierenschnitten in einer Inhibition der NHE3-Aktivität. Durch direkte und indirekte Messungen der PKA-Aktivität wurde gezeigt, dass der durch EPAC induzierte Effekt unabhängig von der PKA-Aktivierung war. Desweiteren waren die Effekte von PKA und EPAC unabhängig von Phospholipase C (PLC) Aktivierung, da die PLC-Aktivität durch keinen der beiden Aktivatoren (PKA und EPAC) beeinflusst wurde. Dennoch waren sowohl die PKA- als auch die EPAC-induzierte Inhibition von NHE3 sensitiv gegenüber einem MEK1/2-spezifischen Inhibitor. Dies impliziert eine Rolle von ERK1/2 in diesem Prozess. Sowohl PKA als auch EPAC inhibierten die Aktivität von NHE3, ohne dass sich die Expression des Transporters in der Membran änderte. Andererseits führte PKA-Aktivierung, aber nicht EPAC-Aktivierung, zur Inhibition der NaPi-IIa-Aktivität in OK-Zellen. Diese Inhibition erfolgte über Endozytose. Zusammenfassend deuten diese Resultate darauf hin, dass die Aktivierung von EPAC einen neuen Mechanismus darstellt, der an der Regulierung von NHE3 beteiligt ist. Die Regulierung von NaPi-IIa ist hingegen nur über PKA gesteuert.

The type IIa Na/Pi-cotransporter (NaPi-lla; SLC34A1) is expressed in the brush border membrane (BBM) of renal proximal tubules where it mediates the bulk of Pi reabsorption from the primary urine. The Na/H-exchanger 3 (NHE3; SLC9A3) is also expressed in the BBM of proximal tubules and plays a major role in acid-base and extracellular volume regulation. Both NaPi-IIa and NHE3 are regulated by parathyroid hormone (PTH) and dopamine (DA). In the case of NaPi-IIa, both hormones induce membrane retrieval and lysosomal degradation. In contrast, NHE3 activity is inhibited in an early phase without reduction of the transporter expression in the BBM. PTH and DA receptors belong to the superfamily of G-protein coupled receptors (GPCR) and signal via activation of adenylyl cyclase (AC) and phospholipase C (PLC). Activation of AC with the subsequent increase in intracellular cAMP plays a key role in the regulation of both NaPi-IIa and NHE3. Intracellular cAMP signals through two independent pathways: the cAMP-dependent protein kinase A (PKA) and the guanine exchange protein directly activated by cAMP (EPAC). The aim of this study was to investigate the contribution of the PKA- and the EPAC- dependent pathways in the regulation of NaPi-IIa and NHE3. For that purpose, the activity of NaPi-IIa and NHE3 was determined in the absence/presence of several cAMP analogs which preferentially activate either the PKA or EPAC pathway. Studies were performed in Opossum kidney (OK) cells and in slices from mouse kidney. OK cells express endogenous NHE3 and NaPi-IIa transporters that are properly (apically) expressed and regulated. On the other hand, our lab has shown that slices from mouse kidney retain their morphological and functional properties within the time frame in which the effects of the different analogs were investigated. NHE3 activity was determined in OK cells by measurements of Na+-dependent intracellular pH recovery rates, and in BBMV (isolated from slices of mouse kidney) by acridine-orange fluorimetry. NaPi-IIa activity was determined in OK cells by measurement of Na+- dependent 32P-uptake. Activation of either the PKA or EPAC pathway resulted in inhibition of NHE3 activity, both in OK cells and kidney slices. The EPAC-induced effect was independent of PKA activation, as indicated by direct and indirect measurements of PKA activity. The PKA and EPAC effects were independent of activation of phospholipase C (PLC), as PLC activity was affected by neither activator. However, the PKA- as well as the EPAC- induced inhibition of NHE3 was sensitive to a MEK1/2-specific inhibitor, suggesting the implication of ERK1/2 in that process. Both PKA and EPAC inhibited NHE3 activity without inducing changes in the expression of the transporter in the BBM, suggesting that inhibition may involve modification of surface expressed transporters. On another hand, activation of PKA, but not of EPAC, inhibited NaPi-lla activity in OK cells. The PKA-induced inhibition was mediated by endocytosis. In summary, these results suggest that EPAC activation may represent a novel mechanism involved in the cAMP regulation of NHE3, whereas regulation of NaPi-lla is mediated by PKA only.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Murer Heini, Hernando Nati
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2006
Deposited On:05 Jun 2019 14:45
Last Modified:15 Apr 2021 14:58
Number of Pages:77
OA Status:Green

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