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Structure, specificity and inhibition of human caspase-3 and -8


Ganesan, Rajkumar. Structure, specificity and inhibition of human caspase-3 and -8. 2006, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Caspasen stellen eine Familie von Cystein-Proteasen dar und sind die hauptsächlichen Effektor-Moleküle beim programmierten Zelltod (Apoptose). Die Apotose spielt eine wichtige Rolle bei der geordneten Elimination von Zellen in der normalen Entwicklung und bei der Zellhomeostase. Wirkstoffe zur Modulierung der Caspase Aktivität sind von grossem Interesse für die Therapie verschiedener wichtiger Krankheiten wie AIDS, Schlaganfall und vieler neurodegenerativer Erkrankungen. Mehrere irreversibel wirkende Breitspektrum-Caspase-Inhibitoren sind bekannt und deren Wirksamkeit, in- vivo und in-vitro, ist für eine Reihe von Krankheits-Modellen beschrieben worden. Die Entwicklung von spezifischen Caspase-Inhibitoren mit der gewünschten therapeutischen Wirkung stelltjedoch immer noch eine grosse Herausforderung dar. Ein wichtiger Grund dafür sind die sich teilweise überschneidenden Substratspezifitäten der verschiedenen Enzyme der Caspase-Familie. Detaillierte strukturelle Informationen über die Substratbindungsstellen Sind eine wichtige Voraussetzung für das gezielte Design von Inhibitoren, mit der gewüschten Spezifität für eine bestimmte Caspase. Caspase-3 ist ein zentrales Enzym in der signaltransduktion der Apoptose und spielt daher eine wichtige Rolle beim Programmierten Zelltod. Das primäre Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war die strukturelle Untersuchung und Charakterisierung der Caspase-3, im Hinblick auf ihre Spezifität und Inhibition durch peptidische, peptidomimetische und nicht-peptidische Inhibitoren. Kapitel 1 gibt eine kurze Einleitung über die Apoptose und die Caspasen. Im zweiten Kapitel wird der Aufbau des aktiven Zentrums von Caspase-3 detailliert beschrieben. Durch die Bestimmung der Kristallstruktur von Caspase-3 im Komplex mit dem peptidischen Inhibitor Z-DEVD-cmk bei einer maximalen Auflösung von 1.06Å konnte gezeigt werden, dass der N-terminale loop von β-Untereinheit des Enzyms bei der Substrat-Erkennung eine Rolle spielt. Ausserdem führte dise strukturelle Untersuchung zur Identifikation eines tetraedrischen Zwischenprodukts, welches eventuell während der katalytischen Reaktion gebildet wird. Die Kapitel 3 und 4 geben einen strukturellen Einblick in Aza-Peptide und Michael- Akzeptoren als eine neue Klasse von irreversiblen und hochspezifischen Caspase- Inhibitoren. Aldehyde und Halogen-Methylketone sind elektrophile Gruppen, die häufig als sogenannte "warheads" beim Design von Caspase-Inhibitoren verwendet werden. Die unspezifische Natur dieser "warheads" im Hinblick auf die Inhibition von auch anderen, verwandten Proteasen, war ein Grund für die Suche nach Caspase- spezifischen elektrophilen Gruppen. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten detaillierten strukturellen Untersuchungen dieser Inhibitoren im Komplex mit Caspase- 3 und -8 führten zur Aufklärung des struktur-basierten Inhibitions-Mechanismus, des Bindungsmodus und der Spezifität in der "prime site" der Substratbindungstasche. Das Verstehen der Wechselwirkungen zwischen den als Inhibitoren wirkenden kleinen Molekülen und Caspasen auf atomarer Basis, bildet eine wichtige Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. In-silico Screening, in-vitro Aktivitätstests und die Strukturbestimmung von Protein:Liganden-Komplexen wurden zur Identifikation und der sich daraus ergebenden möglichen Optimierung der gefundenen Substanzen, die entweder an das aktive Zentrum oder an eine allosterische Bindungsstelle binden, eingesetzt. Zusätzlich zur Identifikation von neuen, nicht-peptidischen Inhibitoren, konnten die Kristallstrukturen der Komplexe von Caspase-3 mit drei dieser nicht- peptidischen Inhibitoren aufgeklärt warden. Die durchgeführten Versuche zur Strukturaufklärung einer Procaspase-3, der Caspase- 5 und der S4 subsite-Mutanten von Caspase-8 sind im Anhang beschrieben.

Caspases constitute a family of cysteine proteases and are the key effector molecules of the programmed cell death/apoptosis. Apoptosis plays an important role in animal development and tissue homeostasis. Agents modulating the caspase activity are of great interest for the treatment of a wide variety of diseases, including cancer, AIDS, stroke and many neurodegenerative disorders. Several irreversible broad-spectrum caspase inhibitors have been identified and their in-vivo and in-vitro efficacy has been reported, in a variety of acute disease models. The design of specific caspase inhibitors with desirable therapeutic benefit remains a challenge, mostly due to the overlapping substrate specificity demonstrated among the caspase family members. Comprehensive structural information with respect to the substrate binding sites is a prerequisite for the design of inhibitors with desirable selectivity for a particular caspase. Caspase-3 is the primary executioner caspase which leads the cellular autodestruction process. This thesis work has its emphasis on the characterization of the structure, specificity and inhibition of caspase-3 using peptidic, peptidomimetic and small molecule inhibitors. The introduction to caspases and apoptosis are discussed in Chapter 1. In Chapter 2, the architecture of caspase-3 active site is discussed in detail. The crystal structure of caspase-3 in complex with a peptidic inhibitor Z-DEVD-cmk resolved at 1.06Å led to the identification of the role of the N-terminal loop and the residues encompassing this loop in the recognition of the substrates. Additionally the study led to the identification of a tetrahedral reaction intermediate which might be formed during the course of the catalytic reaction. Chapters 3 and 4 provide structural insights into the azapeptide epoxide and Michael acceptor inhibitors, two new classes of irreversible and highly specific inhibitors for caspases. The commonly used warheads (electrophilic groups) in the design of inhibitors for caspase include aldehydes and halogen methylketones. The unspecific nature of these warheads to inhibit other related proteases is the reason to search for caspase specific electrophilic groups. A comprehensive structural investigation of these inhibitors in complex with caspase-3 and 8 were performed. The studies reveal the mechanism of inhibition and the mode of binding especially in the prime site of caspases for these inhibitors. Understanding the interaction between small molecules and caspases at the atomic level is imperative for the development of novel drugs. An in silico screening followed by an in vitro functional assay coupled to the determination of the structures of the protein ligand complexes was used to identify and optimize lead compounds that bind either in the active site or in an allosteric site (Chapter 5). New non-peptidic inhibitors were identified and the crystal structures of three caspase: small molecule inhibitor complexes were determined. The work performed on procaspase-3, caspase-5 and the S4 subsite mutants of caspase-8 are presented in the appendices.

Abstract

Caspasen stellen eine Familie von Cystein-Proteasen dar und sind die hauptsächlichen Effektor-Moleküle beim programmierten Zelltod (Apoptose). Die Apotose spielt eine wichtige Rolle bei der geordneten Elimination von Zellen in der normalen Entwicklung und bei der Zellhomeostase. Wirkstoffe zur Modulierung der Caspase Aktivität sind von grossem Interesse für die Therapie verschiedener wichtiger Krankheiten wie AIDS, Schlaganfall und vieler neurodegenerativer Erkrankungen. Mehrere irreversibel wirkende Breitspektrum-Caspase-Inhibitoren sind bekannt und deren Wirksamkeit, in- vivo und in-vitro, ist für eine Reihe von Krankheits-Modellen beschrieben worden. Die Entwicklung von spezifischen Caspase-Inhibitoren mit der gewünschten therapeutischen Wirkung stelltjedoch immer noch eine grosse Herausforderung dar. Ein wichtiger Grund dafür sind die sich teilweise überschneidenden Substratspezifitäten der verschiedenen Enzyme der Caspase-Familie. Detaillierte strukturelle Informationen über die Substratbindungsstellen Sind eine wichtige Voraussetzung für das gezielte Design von Inhibitoren, mit der gewüschten Spezifität für eine bestimmte Caspase. Caspase-3 ist ein zentrales Enzym in der signaltransduktion der Apoptose und spielt daher eine wichtige Rolle beim Programmierten Zelltod. Das primäre Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war die strukturelle Untersuchung und Charakterisierung der Caspase-3, im Hinblick auf ihre Spezifität und Inhibition durch peptidische, peptidomimetische und nicht-peptidische Inhibitoren. Kapitel 1 gibt eine kurze Einleitung über die Apoptose und die Caspasen. Im zweiten Kapitel wird der Aufbau des aktiven Zentrums von Caspase-3 detailliert beschrieben. Durch die Bestimmung der Kristallstruktur von Caspase-3 im Komplex mit dem peptidischen Inhibitor Z-DEVD-cmk bei einer maximalen Auflösung von 1.06Å konnte gezeigt werden, dass der N-terminale loop von β-Untereinheit des Enzyms bei der Substrat-Erkennung eine Rolle spielt. Ausserdem führte dise strukturelle Untersuchung zur Identifikation eines tetraedrischen Zwischenprodukts, welches eventuell während der katalytischen Reaktion gebildet wird. Die Kapitel 3 und 4 geben einen strukturellen Einblick in Aza-Peptide und Michael- Akzeptoren als eine neue Klasse von irreversiblen und hochspezifischen Caspase- Inhibitoren. Aldehyde und Halogen-Methylketone sind elektrophile Gruppen, die häufig als sogenannte "warheads" beim Design von Caspase-Inhibitoren verwendet werden. Die unspezifische Natur dieser "warheads" im Hinblick auf die Inhibition von auch anderen, verwandten Proteasen, war ein Grund für die Suche nach Caspase- spezifischen elektrophilen Gruppen. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten detaillierten strukturellen Untersuchungen dieser Inhibitoren im Komplex mit Caspase- 3 und -8 führten zur Aufklärung des struktur-basierten Inhibitions-Mechanismus, des Bindungsmodus und der Spezifität in der "prime site" der Substratbindungstasche. Das Verstehen der Wechselwirkungen zwischen den als Inhibitoren wirkenden kleinen Molekülen und Caspasen auf atomarer Basis, bildet eine wichtige Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. In-silico Screening, in-vitro Aktivitätstests und die Strukturbestimmung von Protein:Liganden-Komplexen wurden zur Identifikation und der sich daraus ergebenden möglichen Optimierung der gefundenen Substanzen, die entweder an das aktive Zentrum oder an eine allosterische Bindungsstelle binden, eingesetzt. Zusätzlich zur Identifikation von neuen, nicht-peptidischen Inhibitoren, konnten die Kristallstrukturen der Komplexe von Caspase-3 mit drei dieser nicht- peptidischen Inhibitoren aufgeklärt warden. Die durchgeführten Versuche zur Strukturaufklärung einer Procaspase-3, der Caspase- 5 und der S4 subsite-Mutanten von Caspase-8 sind im Anhang beschrieben.

Caspases constitute a family of cysteine proteases and are the key effector molecules of the programmed cell death/apoptosis. Apoptosis plays an important role in animal development and tissue homeostasis. Agents modulating the caspase activity are of great interest for the treatment of a wide variety of diseases, including cancer, AIDS, stroke and many neurodegenerative disorders. Several irreversible broad-spectrum caspase inhibitors have been identified and their in-vivo and in-vitro efficacy has been reported, in a variety of acute disease models. The design of specific caspase inhibitors with desirable therapeutic benefit remains a challenge, mostly due to the overlapping substrate specificity demonstrated among the caspase family members. Comprehensive structural information with respect to the substrate binding sites is a prerequisite for the design of inhibitors with desirable selectivity for a particular caspase. Caspase-3 is the primary executioner caspase which leads the cellular autodestruction process. This thesis work has its emphasis on the characterization of the structure, specificity and inhibition of caspase-3 using peptidic, peptidomimetic and small molecule inhibitors. The introduction to caspases and apoptosis are discussed in Chapter 1. In Chapter 2, the architecture of caspase-3 active site is discussed in detail. The crystal structure of caspase-3 in complex with a peptidic inhibitor Z-DEVD-cmk resolved at 1.06Å led to the identification of the role of the N-terminal loop and the residues encompassing this loop in the recognition of the substrates. Additionally the study led to the identification of a tetrahedral reaction intermediate which might be formed during the course of the catalytic reaction. Chapters 3 and 4 provide structural insights into the azapeptide epoxide and Michael acceptor inhibitors, two new classes of irreversible and highly specific inhibitors for caspases. The commonly used warheads (electrophilic groups) in the design of inhibitors for caspase include aldehydes and halogen methylketones. The unspecific nature of these warheads to inhibit other related proteases is the reason to search for caspase specific electrophilic groups. A comprehensive structural investigation of these inhibitors in complex with caspase-3 and 8 were performed. The studies reveal the mechanism of inhibition and the mode of binding especially in the prime site of caspases for these inhibitors. Understanding the interaction between small molecules and caspases at the atomic level is imperative for the development of novel drugs. An in silico screening followed by an in vitro functional assay coupled to the determination of the structures of the protein ligand complexes was used to identify and optimize lead compounds that bind either in the active site or in an allosteric site (Chapter 5). New non-peptidic inhibitors were identified and the crystal structures of three caspase: small molecule inhibitor complexes were determined. The work performed on procaspase-3, caspase-5 and the S4 subsite mutants of caspase-8 are presented in the appendices.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Grütter Markus G, Dutzler Raimund
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2006
Deposited On:14 Jun 2019 10:24
Last Modified:25 Sep 2019 00:11
Number of Pages:193
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005204745&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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