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Elucidation of the interaction network between yeast DNA processing proteins using endogenously tagged ORFs and the LiquiChip technology


Hort, Jacqueline Lilian. Elucidation of the interaction network between yeast DNA processing proteins using endogenously tagged ORFs and the LiquiChip technology. 2005, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Wir wollten ein System erschaffen um in der Hefe, Saccharomyces cerevisiae, Proteininteraktionen im Bereich der DNA Vermehrung, Rekombination und Reparatur zu analysieren. Das Ziel war die Entwicklung einer neuen in vivo high-throughput Technik, welche Interaktionen zwischen Hefeproteinpaaren erfasst. Wir erschufen zwei neue Hefelinien indem wir die gewünschten ORFs mit 6xHis(Bait) und 3xVSV(Prey) endogen markierten. Wir generierten 927 ORFs, davon 470 Baits und 457 Preys, alle involviert in der DNA Verarbeitung. Haploide Hefelinien wurden gepaart wodurch wir diploide Linien erhielten, welche das Bait- und Preyprotein exprimierten. Proteinextrakte wurden hergestellt und inkubiert mit Ni-Beads, welche sich an den Bait binden, sowie einem fluoreszierenden Antikörper, der den Prey erkennt. Wir analysierten die Proben mit der LiquiChip Technologie (Qiagen Inc.), welche mit Lasern die mit dem Bait gekoppelten Beats einzeln erfasst und sie auf das Vorhandensein des durch den Antikörper fluoreszierenden Preyproteins untersucht, und somit eine mögliche Proteininteraktion erfasst. Als Positivkontrolle diente uns der Casein Kinase II Komplex. Es gelang uns Interaktionen zwischen den verschiedenen Mitgliedern der Protein Kinase II Familie zu erfassen. Um die Bindung des Bait mit den Beats zu verifizieren machten wir zusätzlich in vivo Pull Downs mit Nickelbeads gefolgt von einem Western Blot, um das Vorhandensein des Interaktionspartners zu bestätigen.

In the yeast Saccharomyces cerevisiae, we wanted to set a foundation for examination of protein interactions involved in DNA replication, recombination and repair. The goal was to establish a novel in vivo high-throughput technique to test for binary protein interactions in yeast. We created two new yeast arrays by endogenously tagging the selected yeast ORFs with 6xHis(bait) and 3xVSV(prey) tags, respectively. We generated 927 tagged ORFs involved in DNA processing, of which 470 are baits and 457 preys. Using an array format, haploid yeast were mated to generate diploids expressing both bait and prey proteins. The protein extracts were prepared and incubated with Ni-Beads, binding to the bait and a fluorescently labeled antibody recognizing the prey. We analysed the samples by the LiquiChip technology, originally developed at Qiagen Inc., using lasers to examine single beads loaded with bait for the presence or absence of the fluorescently labeled prey protein, thus determining the interaction status between bait and prey. As a proof of principle, we examined control strains of the Casein Kinase II complex. Using this approach, we were able to detect interactions between different members of this Protein Kinase II family. To verify the binding of the bait to the beads, as well as the presence of the interacting partner, we performed in vivo pull down assays using the nickelbeads following western blot analyses to detect the interacting prey protein.

Abstract

Wir wollten ein System erschaffen um in der Hefe, Saccharomyces cerevisiae, Proteininteraktionen im Bereich der DNA Vermehrung, Rekombination und Reparatur zu analysieren. Das Ziel war die Entwicklung einer neuen in vivo high-throughput Technik, welche Interaktionen zwischen Hefeproteinpaaren erfasst. Wir erschufen zwei neue Hefelinien indem wir die gewünschten ORFs mit 6xHis(Bait) und 3xVSV(Prey) endogen markierten. Wir generierten 927 ORFs, davon 470 Baits und 457 Preys, alle involviert in der DNA Verarbeitung. Haploide Hefelinien wurden gepaart wodurch wir diploide Linien erhielten, welche das Bait- und Preyprotein exprimierten. Proteinextrakte wurden hergestellt und inkubiert mit Ni-Beads, welche sich an den Bait binden, sowie einem fluoreszierenden Antikörper, der den Prey erkennt. Wir analysierten die Proben mit der LiquiChip Technologie (Qiagen Inc.), welche mit Lasern die mit dem Bait gekoppelten Beats einzeln erfasst und sie auf das Vorhandensein des durch den Antikörper fluoreszierenden Preyproteins untersucht, und somit eine mögliche Proteininteraktion erfasst. Als Positivkontrolle diente uns der Casein Kinase II Komplex. Es gelang uns Interaktionen zwischen den verschiedenen Mitgliedern der Protein Kinase II Familie zu erfassen. Um die Bindung des Bait mit den Beats zu verifizieren machten wir zusätzlich in vivo Pull Downs mit Nickelbeads gefolgt von einem Western Blot, um das Vorhandensein des Interaktionspartners zu bestätigen.

In the yeast Saccharomyces cerevisiae, we wanted to set a foundation for examination of protein interactions involved in DNA replication, recombination and repair. The goal was to establish a novel in vivo high-throughput technique to test for binary protein interactions in yeast. We created two new yeast arrays by endogenously tagging the selected yeast ORFs with 6xHis(bait) and 3xVSV(prey) tags, respectively. We generated 927 tagged ORFs involved in DNA processing, of which 470 are baits and 457 preys. Using an array format, haploid yeast were mated to generate diploids expressing both bait and prey proteins. The protein extracts were prepared and incubated with Ni-Beads, binding to the bait and a fluorescently labeled antibody recognizing the prey. We analysed the samples by the LiquiChip technology, originally developed at Qiagen Inc., using lasers to examine single beads loaded with bait for the presence or absence of the fluorescently labeled prey protein, thus determining the interaction status between bait and prey. As a proof of principle, we examined control strains of the Casein Kinase II complex. Using this approach, we were able to detect interactions between different members of this Protein Kinase II family. To verify the binding of the bait to the beads, as well as the presence of the interacting partner, we performed in vivo pull down assays using the nickelbeads following western blot analyses to detect the interacting prey protein.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Stagljar Igor
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2005
Deposited On:20 Jun 2019 09:59
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:84
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005277422&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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