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Validierung des ArrayTube-Mikrochip als neue diagnostische Methode zur Chlamydiendetektion und Chlamydienidentifizierung


Winter-Kempf, Evelyne. Validierung des ArrayTube-Mikrochip als neue diagnostische Methode zur Chlamydiendetektion und Chlamydienidentifizierung. 2006, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Zusammenfassung Obwohl die Mikroarray-Technologie in mRNA-Expressionsanalysen zur Analyse von Gentranskriptionsmuster ein weit verbreitetes Mittel ist, wird sie bei der schnellen Diagnose von Pathogenen wie Bakterien und Viren noch nicht so häufig angewendet. Bis jetzt sind ungenügende Sensitivität bei der Detektion und hohe Kosten der Geräte der Hauptfaktor der eine Weiterverbreitung der Mikroarrays beim Testen der klinischen Proben im grossen Stil verhindern. Das ArrayTube-System repräsentiert eine flexible und kostengünstige Plattform mit integriertem Mikrochip am Boden eines 1,5-ml Reaktionsröhrchens aus Plastik. In der vorliegenden Studie wurde die neue Methode des ArrayTube®-Mikroarray-Systems für die Routinediagnostik zur Detektion und Identifizierung von Chlamydia- und Chlamydophila- Spezies etabliert. Das AT-System wurde mit anderen Diagnostikverfahren verglichen. Als Hauptreferenzmethode wurde die 16S-rDNA PCR, modifiziert nach Everett et al., 1999, herangezogen. Als weitere Referenzmethoden dienten die IGS-S-, IGS-L-PCR, die 23SDNA- Real-Time-PCR und die Immunhistologie (IHC). Es wurde einerseits formalin-fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe, Zellkulturen und Zellpellets und andererseits Frischmaterial (Nasen- und Augentupfer und Milchproben) untersucht. Zur Sensitivitäts- und Spezifitätsstudie wurde DNA von anderen Bakterien und DNA von Cp. abortus in Wasser und Ejakulaten als Verdünnungsreihen untersucht. Total wurden 340 Proben, davon 236 klinische Proben von Mensch und Tier mit dem AT untersucht. Der Vorteil der Methode des AT gegenüber vielen anderen in der Studie beschriebenen Methoden ist die zeitsparende und einfache Handhabung und der günstige Preis einer einzelnen Untersuchung. Weitere Vorteile sind die sehr hohe Sensitivität und Spezifität. Der Test kann in einem einzigen Tag durchgeführt werden und umfasst die DNA-Extraktion mit einem kommerziellen Kit, Amplifikation und Biotinylierung der Ziel- DNA , die Hybridisierung auf dem Chip und die Signal-Auswertung. Der Vergleich des Mikroarrays mit der Real-time PCR, konventionellen PCR-Protokollen und auch mit der Immunhistochemie und anderen Testen zeigte einen hohen Grad an Konkordanz. Zudem ist der AT in der Lage auch Mischinfektionen mit zwei oder mehr Chlamydienspezies in klinischen Proben und experimentell infizierten Zellkulturen zu detektieren. Die errechnete mittlere Sensitivität des Systems war 0.81 (n = 236) und ist vergleichbar mit der Real-time PCR oder der konventionellen 16S PCR.
Summary While DNA microarrays have become a widely accepted tool for mRNA expression monitoring in gene transcription analysis, their use in rapid diagnosis of bacterial and viral pathogens is only emerging. So far, insufficient sensitivity of detection and high costs of equipment have been the major limiting factors preventing more widespread use of microarray platforms in direct testing of clinical samples. In the present study, a total of 340 samples, among them 236 clinical specimens from animals and humans, were examined by the ArrayTubeTM (AT) DNA microarray assay to detect chlamydial DNA and identify the species of Chlamydia and Chlamydophila involved. Samples included nasal and conjunctival swabs, formalin-fixed, paraffin-embedded and fresh organ tissue, milk, feces and cell culture. Comparison of microarray findings with real-time PCR, conventional PCR, as well as immunohistochemistry and other tests, revealed satisfactory parameters of accuracy and performance for the new test. Notably, the AT test was shown to detect mixed infections in both clinical samples and experimentally infected cell culture. The calculated median sensitivity of 0.81 over the entire panel of clinical samples was comparable to conventional 16S PCR. Altogether, the data demonstrate the suitability of this DNA microarray assay for routine diagnosis.

Abstract

Zusammenfassung Obwohl die Mikroarray-Technologie in mRNA-Expressionsanalysen zur Analyse von Gentranskriptionsmuster ein weit verbreitetes Mittel ist, wird sie bei der schnellen Diagnose von Pathogenen wie Bakterien und Viren noch nicht so häufig angewendet. Bis jetzt sind ungenügende Sensitivität bei der Detektion und hohe Kosten der Geräte der Hauptfaktor der eine Weiterverbreitung der Mikroarrays beim Testen der klinischen Proben im grossen Stil verhindern. Das ArrayTube-System repräsentiert eine flexible und kostengünstige Plattform mit integriertem Mikrochip am Boden eines 1,5-ml Reaktionsröhrchens aus Plastik. In der vorliegenden Studie wurde die neue Methode des ArrayTube®-Mikroarray-Systems für die Routinediagnostik zur Detektion und Identifizierung von Chlamydia- und Chlamydophila- Spezies etabliert. Das AT-System wurde mit anderen Diagnostikverfahren verglichen. Als Hauptreferenzmethode wurde die 16S-rDNA PCR, modifiziert nach Everett et al., 1999, herangezogen. Als weitere Referenzmethoden dienten die IGS-S-, IGS-L-PCR, die 23SDNA- Real-Time-PCR und die Immunhistologie (IHC). Es wurde einerseits formalin-fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe, Zellkulturen und Zellpellets und andererseits Frischmaterial (Nasen- und Augentupfer und Milchproben) untersucht. Zur Sensitivitäts- und Spezifitätsstudie wurde DNA von anderen Bakterien und DNA von Cp. abortus in Wasser und Ejakulaten als Verdünnungsreihen untersucht. Total wurden 340 Proben, davon 236 klinische Proben von Mensch und Tier mit dem AT untersucht. Der Vorteil der Methode des AT gegenüber vielen anderen in der Studie beschriebenen Methoden ist die zeitsparende und einfache Handhabung und der günstige Preis einer einzelnen Untersuchung. Weitere Vorteile sind die sehr hohe Sensitivität und Spezifität. Der Test kann in einem einzigen Tag durchgeführt werden und umfasst die DNA-Extraktion mit einem kommerziellen Kit, Amplifikation und Biotinylierung der Ziel- DNA , die Hybridisierung auf dem Chip und die Signal-Auswertung. Der Vergleich des Mikroarrays mit der Real-time PCR, konventionellen PCR-Protokollen und auch mit der Immunhistochemie und anderen Testen zeigte einen hohen Grad an Konkordanz. Zudem ist der AT in der Lage auch Mischinfektionen mit zwei oder mehr Chlamydienspezies in klinischen Proben und experimentell infizierten Zellkulturen zu detektieren. Die errechnete mittlere Sensitivität des Systems war 0.81 (n = 236) und ist vergleichbar mit der Real-time PCR oder der konventionellen 16S PCR.
Summary While DNA microarrays have become a widely accepted tool for mRNA expression monitoring in gene transcription analysis, their use in rapid diagnosis of bacterial and viral pathogens is only emerging. So far, insufficient sensitivity of detection and high costs of equipment have been the major limiting factors preventing more widespread use of microarray platforms in direct testing of clinical samples. In the present study, a total of 340 samples, among them 236 clinical specimens from animals and humans, were examined by the ArrayTubeTM (AT) DNA microarray assay to detect chlamydial DNA and identify the species of Chlamydia and Chlamydophila involved. Samples included nasal and conjunctival swabs, formalin-fixed, paraffin-embedded and fresh organ tissue, milk, feces and cell culture. Comparison of microarray findings with real-time PCR, conventional PCR, as well as immunohistochemistry and other tests, revealed satisfactory parameters of accuracy and performance for the new test. Notably, the AT test was shown to detect mixed infections in both clinical samples and experimentally infected cell culture. The calculated median sensitivity of 0.81 over the entire panel of clinical samples was comparable to conventional 16S PCR. Altogether, the data demonstrate the suitability of this DNA microarray assay for routine diagnosis.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Pospischil Andreas, Hoop R
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:German
Place of Publication:Zürich
Date:2006
Deposited On:20 Jun 2019 12:17
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:81
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005352972&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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Language: German
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