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Random cross-species identification of a gene encoding for an inorganic pyrophosphatase in the uncultivable hemotrophic bacterium Mycoplasma suis


Sidler, Michèle. Random cross-species identification of a gene encoding for an inorganic pyrophosphatase in the uncultivable hemotrophic bacterium Mycoplasma suis. 2007, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden zwei M. suis-Genbibliotheken auf die Gene Enolase und Pyruvatdehydrogenase (PDH) untersucht. Für die „cross species identification“ wurden DNA Sonden aus dem Enolase- und PDH-Gen des nahe verwandten humanpathogenen Agens M. pneumoniae verwendet. Um die in den Genbibliotheken zu etwa 90% enthaltenen Escherichia (E.) coli-Klone mit Inserts aus porziner DNA auszusortieren, wurden sämtliche Klone zunächst mit einer Biotin-markierten DNA-Sonde gegen porzine DNA hybridisiert. Sämtliche Klone mit positiven Hybridisierungsreaktionen mit porziner DNA wurden ausselektiert. Bei insgesamt 600 Klonen fiel diese DNA-Hybridisierung negativ aus, so dass sie als potentielle Träger eines M. suis-DNA-inserts gelten konnten. In Southern blot-Analysen der 600 E. coli-Klone mit den DNA-Sonden gegen M. pneumoniae Enolase und PDH konnten 30 Klone identifiziert werden, die mit einer der beiden Sonden spezifisch hybridisierten. Durch Sequenzanalyse der DNA-inserts wurde das Gen für eine M. suis-spezifische anorganische Pyrophosphatase (ppA) gefunden. Das ppA-Gen hat eine Grösse von 495 bp; die Homologie zu analogen Genen anderer pathogener Mycoplasmen beträgt 53-55%. Der GC-Gehalt beträgt 32%. Die prokaryotische anorganische Pyrophosphatase spielt im bakteriellen Energiestoffwechsel sowie im bakteriellen Protein- und Nukleinsäuremetabolismus eine wichtige Rolle und könnte ein neues Target für antibakterielle Wirkstoffe darstellen. Summary Genome sequence analysis of Mycoplasma suis is hampered due to the lack of an appropriate in vitro cultivating system. The organism has still to be purified from blood samples of experimentally infected pigs, which is linked with technical difficulties. Therefore, little is known about the genome of M. suis. For this work a cross-species random approach, based upon Southern blot, was considered in order to identify novel genes. Two shotgun M. suis genomic libraries were screened using either M. pneumoniae enolase or pyruvate dehydrogenase (PDH) probes. Using these two enzymes as probes is based on recent gained insights of their pathogenicity in mycoplasma infections. Following this strategy the complete open reading frame of a putative M. suis inorganic pyrophosphatase (ppA) was found by hybridizising with a M. pneumoniae enolase probe. The positive hybridization signal is considered to result from the DNA homology of 45% between the M. suis ppA and the M. pneumoniae enolase. The encoding gene ppA is 495 bp in size. The deduced amino acid sequence showed an overall similarity of 53 to 55% with inorganic pyrophosphatases of other pathogenic mycoplasmas, and a GC-content of 32%. This study demonstrates the feasibility and the encountered difficulties of a random cross- species approach to identify novel genes of an uncultivable agent like M. suis.

Abstract

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden zwei M. suis-Genbibliotheken auf die Gene Enolase und Pyruvatdehydrogenase (PDH) untersucht. Für die „cross species identification“ wurden DNA Sonden aus dem Enolase- und PDH-Gen des nahe verwandten humanpathogenen Agens M. pneumoniae verwendet. Um die in den Genbibliotheken zu etwa 90% enthaltenen Escherichia (E.) coli-Klone mit Inserts aus porziner DNA auszusortieren, wurden sämtliche Klone zunächst mit einer Biotin-markierten DNA-Sonde gegen porzine DNA hybridisiert. Sämtliche Klone mit positiven Hybridisierungsreaktionen mit porziner DNA wurden ausselektiert. Bei insgesamt 600 Klonen fiel diese DNA-Hybridisierung negativ aus, so dass sie als potentielle Träger eines M. suis-DNA-inserts gelten konnten. In Southern blot-Analysen der 600 E. coli-Klone mit den DNA-Sonden gegen M. pneumoniae Enolase und PDH konnten 30 Klone identifiziert werden, die mit einer der beiden Sonden spezifisch hybridisierten. Durch Sequenzanalyse der DNA-inserts wurde das Gen für eine M. suis-spezifische anorganische Pyrophosphatase (ppA) gefunden. Das ppA-Gen hat eine Grösse von 495 bp; die Homologie zu analogen Genen anderer pathogener Mycoplasmen beträgt 53-55%. Der GC-Gehalt beträgt 32%. Die prokaryotische anorganische Pyrophosphatase spielt im bakteriellen Energiestoffwechsel sowie im bakteriellen Protein- und Nukleinsäuremetabolismus eine wichtige Rolle und könnte ein neues Target für antibakterielle Wirkstoffe darstellen. Summary Genome sequence analysis of Mycoplasma suis is hampered due to the lack of an appropriate in vitro cultivating system. The organism has still to be purified from blood samples of experimentally infected pigs, which is linked with technical difficulties. Therefore, little is known about the genome of M. suis. For this work a cross-species random approach, based upon Southern blot, was considered in order to identify novel genes. Two shotgun M. suis genomic libraries were screened using either M. pneumoniae enolase or pyruvate dehydrogenase (PDH) probes. Using these two enzymes as probes is based on recent gained insights of their pathogenicity in mycoplasma infections. Following this strategy the complete open reading frame of a putative M. suis inorganic pyrophosphatase (ppA) was found by hybridizising with a M. pneumoniae enolase probe. The positive hybridization signal is considered to result from the DNA homology of 45% between the M. suis ppA and the M. pneumoniae enolase. The encoding gene ppA is 495 bp in size. The deduced amino acid sequence showed an overall similarity of 53 to 55% with inorganic pyrophosphatases of other pathogenic mycoplasmas, and a GC-content of 32%. This study demonstrates the feasibility and the encountered difficulties of a random cross- species approach to identify novel genes of an uncultivable agent like M. suis.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Wittenbrink Max Michael, Hofmann-Lehmann R
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2007
Deposited On:20 Jun 2019 12:57
Last Modified:07 Apr 2020 07:15
Number of Pages:37
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005369054&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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