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A comprehensive test system to identify suitable antibodies against p53 for immunohistochemical analysis of canine tissues


Keller, Stefan. A comprehensive test system to identify suitable antibodies against p53 for immunohistochemical analysis of canine tissues. 2007, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

The tumour suppressor p53 is commonly detected in tissues of companion animals by means of antibodies raised against the human orthologue. The following three-step procedure was devised to test the suitability of such antibodies for immunohistochemistry on canine tissues. (1) Western blot and immunohistochemical analyses on bacterially expressed recombinant canine protein to assess human-to-canine cross-reactivity. (2) Immunohistochemistry of cultured, UVB-irradiated canine keratinocytes to evaluate suitability for detection of endogenous p53. (3) Immunohistochemistry on tissue arrays to further substantiate suitability of the antibodies on a panel of normal and neoplastic human and canine tissues. Five of six antibodies cross-reacted with recombinant canine p53. Three of these (PAb122, PAb240, CM-1) also immunohistochemically recognized stabilized wild type p53 in cell cultures and elicited a consistent, characteristic labelling pattern in a subset of tumours. However, two alternative batches of polyclonal antibody CM-1 failed to detect p53 in cell cultures, while showing a characteristic labelling pattern of a completely different subset of tumours and unspecific labelling of normal tissues. The test system described is well suited to the selection of antibodies for immunohistochemical p53 detection. The results emphasize the need to include appropriate controls, especially for polyclonal antibodies.

Das Tumorsuppressorprotein p53 wird in Geweben von Haustieren häufig mittels Antikörpern nachgewiesen, die gegen das menschliche Protein gerichtet sind. Es wurde folgende dreistufige Methode entwickelt, um die Eignung solcher Antikörper an kaninem Gewebe zu testen. (1) Mit Hilfe von Western Blots und immunhistochemischer Untersuchung von in Bakterien exprimiertem, rekombinantem kaninem p53 wurde die Kreuzreaktivität mit menschlichem Protein geprüft. (2) Endogenes p53 wurde durch Immunhistochemie an UVB-bestrahlten, kaninen Keratinozytenkulturen nachgewiesen. (3) Die Eignung der Antiköper wurde zusätzlich durch immunhistochemische Untersuchung von Tissue Arrays mit enthaltenen neoplastischen und unveränderten Geweben bestätigt. Fünf von sechs Antikörpern kreuzreagierten mit kaninem p53. Drei von diesen (PAb122, PAb240, CM-1) erkannten außerdem stabilisiertes wt p53 in Zellkulturen und zeigten ein charakteristisches Färbemuster in einem Teil der Tumoren. Zwei andere Chargen des CM-1 Antikörpers erkannten p53 in Zellkulturen nicht. Zusätzlich zeigten diese Antikörper ein charakteristisches Färbemuster bei anderen Tumoren sowie ein unspezifisches Färbemuster in normalem Gewebe. Das beschriebene Testverfahren ist zur Auswahl von Antikörpern für den immunhistochemischen Nachweis von p53 gut geeignet. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit geeigneter Kontrollen, besonders bei der Verwendung von polyklonalen Antikörpern.

Abstract

The tumour suppressor p53 is commonly detected in tissues of companion animals by means of antibodies raised against the human orthologue. The following three-step procedure was devised to test the suitability of such antibodies for immunohistochemistry on canine tissues. (1) Western blot and immunohistochemical analyses on bacterially expressed recombinant canine protein to assess human-to-canine cross-reactivity. (2) Immunohistochemistry of cultured, UVB-irradiated canine keratinocytes to evaluate suitability for detection of endogenous p53. (3) Immunohistochemistry on tissue arrays to further substantiate suitability of the antibodies on a panel of normal and neoplastic human and canine tissues. Five of six antibodies cross-reacted with recombinant canine p53. Three of these (PAb122, PAb240, CM-1) also immunohistochemically recognized stabilized wild type p53 in cell cultures and elicited a consistent, characteristic labelling pattern in a subset of tumours. However, two alternative batches of polyclonal antibody CM-1 failed to detect p53 in cell cultures, while showing a characteristic labelling pattern of a completely different subset of tumours and unspecific labelling of normal tissues. The test system described is well suited to the selection of antibodies for immunohistochemical p53 detection. The results emphasize the need to include appropriate controls, especially for polyclonal antibodies.

Das Tumorsuppressorprotein p53 wird in Geweben von Haustieren häufig mittels Antikörpern nachgewiesen, die gegen das menschliche Protein gerichtet sind. Es wurde folgende dreistufige Methode entwickelt, um die Eignung solcher Antikörper an kaninem Gewebe zu testen. (1) Mit Hilfe von Western Blots und immunhistochemischer Untersuchung von in Bakterien exprimiertem, rekombinantem kaninem p53 wurde die Kreuzreaktivität mit menschlichem Protein geprüft. (2) Endogenes p53 wurde durch Immunhistochemie an UVB-bestrahlten, kaninen Keratinozytenkulturen nachgewiesen. (3) Die Eignung der Antiköper wurde zusätzlich durch immunhistochemische Untersuchung von Tissue Arrays mit enthaltenen neoplastischen und unveränderten Geweben bestätigt. Fünf von sechs Antikörpern kreuzreagierten mit kaninem p53. Drei von diesen (PAb122, PAb240, CM-1) erkannten außerdem stabilisiertes wt p53 in Zellkulturen und zeigten ein charakteristisches Färbemuster in einem Teil der Tumoren. Zwei andere Chargen des CM-1 Antikörpers erkannten p53 in Zellkulturen nicht. Zusätzlich zeigten diese Antikörper ein charakteristisches Färbemuster bei anderen Tumoren sowie ein unspezifisches Färbemuster in normalem Gewebe. Das beschriebene Testverfahren ist zur Auswahl von Antikörpern für den immunhistochemischen Nachweis von p53 gut geeignet. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit geeigneter Kontrollen, besonders bei der Verwendung von polyklonalen Antikörpern.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Guscetti Franco, Nägeli Hanspeter
Communities & Collections:05 Vetsuisse Faculty > Institute of Veterinary Pharmacology and Toxicology
05 Vetsuisse Faculty > Institute of Veterinary Pathology
UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2007
Deposited On:05 Feb 2019 11:43
Last Modified:26 Jun 2020 15:31
Number of Pages:0
Additional Information:Vorzeitig publiziert in und Sonderdruck aus: Journal of Comparative Pathology 2007, Vol. 137
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/permalink/f/5u2s2l/ebi01_prod005435214 (Library Catalogue)

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