Cloning and sequence analysis of canine apoptosis-associated molecules

Abstract

The aim of the study was to clone and sequence the coding sequences of a representative set of proteins, primarily from the intrinsic apoptotic pathway in dogs and to assess their conservation with human and murine orthologues. cDNA for these proteins, including Bcl-2 family members (Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Bax, Bak, Bad, Noxa), caspases (Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9), Inhibitors of Apoptosis Proteins (XIAP, cIAP-1, cIAP-2, Survivin), their mitochondrial inhibitors (Smac/ DIABLO, Omi/HtrA2) and p53, were generated by RT-PCR with RNA extracted from two canine non-neoplastic cell lines. Eleven sequences are novel for the dog. Interspecies comparison revealed strongest similarity between the sequences of human and canine intrinsic apoptosis pathway members. Differences with potential functional impact, however, were observed in both dogs and mice. In dogs, these changes involve the putative Inhibitor of Apoptosis Protein binding motif of canine Omi/HtrA2, some caspase substrate recognition motifs and some functionally relevant residues of p53. Canine XIAP yields a caspase-cleavage site reported as unique to humans. In conclusion, the generally high degree of similarity of canine apoptosis-associated proteins as compared to human counterparts is supportive of the use of dogs as a model for human diseases. Single interspecies sequence variations with potential functional relevance under physiologic and neoplastic conditions do exist, however, and will require further analysis.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine repräsentative Gruppe von Molekülen, die hauptsächlich am intrinsischen Signalweg der Apoptose beteiligt sind, zu klonieren und sequenzieren, und mit den Homologen von Mensch und Maus zu vergleichen. Mittels RT-PCR, basierend auf RNA aus zwei kaninen nicht-neoplastischen Zelllinien, wurden cDNAs von Bcl-2 Familienmitglieder (Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Bax, Bak, Bad, Noxa), Kaspasen (Kaspase-8, -9, -3), "Inhibitors of Apoptosis" Proteinen (XIAP, cIAP-1, cIAP-2, Survivin), Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 und p53 generiert. Elf dieser Sequenzen werden beim Hund erstmals beschrieben. Die höchste Konservierung der Nukleotid- und Proteinsequenzen wurde zwischen Hund und Mensch festgestellt. Sequenzunterschiede zum Menschen mit potentiell funktionellem Einfluss wurden bei Hund und Maus beobachtet. Darunter fallen beim Hund das mutmassliche "Inhibitor of Apoptosis Protein Binding Motif" von Omi/HtrA2, einige Substraterkennungsmotive von Kaspasen, sowie einige funktionell relevante Aminosäuren von p53. Des weiteren weist das kanine XIAP eine Kaspasen-Spaltstelle auf, die bisher als einzigartig für den Menschen galt. Die generell hohe Ähnlichkeit der Apoptose-assoziierten Proteine des Hundes mit denen des Menschen befürwortet dessen Einsatz als Modelltier für humane Erkrankungen. Einzelne speziesspezifische Sequenzunterschiede mit potentieller funktioneller Relevanz unter physiologischen und neoplastischen Bedingungen bedürfen jedoch weiterer Untersuchungen.