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Ex ovo RNAi for functional gene analysis during neural development


Baeriswyl, Thomas. Ex ovo RNAi for functional gene analysis during neural development. 2007, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

To study gene function in vivo during development of the central nervous system (CNS) efficient model systems that allow for temporal and spatial control of gene expression are required. In our lab, we have used the chicken embryo in combination with in ovo electroporation and RNA interference (RNAi) for gene silencing during early stages of nervous system development. In particular, we used dorsal commissural neurons to study axonal pathfinding. These neurons extend their axons toward the floor plate, the ventral midline of the spinal cord. Guidance cues derived from the floor plate, the intermediate target of these axons, are important for axon growth toward and across the midline. Using in ovo RNAi, we could show that interference with the function of the transmembrane glycoprotein Endoglycan (PODXL2) resulted in the failure to turn or in erroneous caudal turns after midline crossing. Furthermore, the morphology of the floor plate was severely disturbed in the absence of Endoglycan. During later stages of neural development, Endoglycan is expressed by Purkinje cells in the cerebellum. For the functional characterization of Endoglycan during cerebellar development, we extended the experimental accessibility of chicken embryos to much older stages. We established the procedure of ex ovo electroporation and RNAi to manipulate gene expression in the developing cerebellum. The cerebellum represents a well characterized neuronal structure, and therefore, an ideal system to study CNS development, including neurogenesis, differentiation, migration, axon guidance, as well as synapse formation. To demonstrate the applicability and the efficiency of ex ovo RNAi, we analyzed the function of the cell adhesion molecule Axonin-1 in cerebellar development. Axonin-1 is expressed by postmitotic granule cells at the time when they extend their axons, the parallel fibers. In the absence of Axonin-1 the arrangement of granule cell axons within the molecular layer was aberrant and fibers no longer extended parallel but towards the cerebellar surface. The effect of Axonin-1 was not on parallel fiber elongation but affected specifically parallel fiber navigation. The same effects on parallel fiber development observed after ex ovo RNAi were reproduced in embryos treated with function-blocking anti-Axonin-1 antibodies, indicating that ex ovo RNAi efficiently and reproducibly silenced axonin-1 in the developing cerebellum. Thus, we used ex ovo RNAi to study the function of Endoglycan during cerebellar development. Endoglycan is expressed by Purkinje cells at the time when they migrate towards the pial surface to establish the Purkinje cell monolayer. Interference with Endoglycan function caused a severe migration defect of Purkinje cells. Moreover, due to the aberrant formation of the Purkinje cell monolayer, the thickness of the external germinal layer and the proliferation rate of granule cells were significantly reduced causing disturbed foliation and reduced size of the cerebellum. Für die Analyse von Genfunktionen während der Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS) werden effiziente Systeme benötigt, welche es ermöglichen, die Genexpression zeitlich und räumlich zu kontrollieren. In unserem Labor benutzen wir in ovo RNAi (RNA interference), um im Hühnerembryo während früher neuraler Entwicklungsstadien Gene gezielt auszuschalten. Anhand dorsaler Kommissuralneurone studieren wir Wegweisermoleküle, welche Axone zu ihren Zielzellen dirigieren. Axone der Kommissuralneurone wachsen gegen die ventrale Mittelline des Rückenmarks, die Bodenplatte, überqueren diese und wachsen anschliessend in rostraler Richtung weiter. Wegweisermoleküle, welche direkt auf der Bodenplatte lokalisiert sind oder von dieser sezerniert werden, sind wichtig für die korrekte Wegfindung dieser Axone. Mittels in ovo RNAi konnten wir zeigen, dass das Transmembran-Glykoprotein Endoglycan (PODXL2) nach dem Überqueren der Bodenplatte für die anschliessende rostrale Drehung von Kommissuralaxonen wichtig ist. Der Verlust von Endoglycan-Aktivität führte zu Stillstehen am Ausgang der Bodenplatte und fehlerhaftem caudalen Wachsen von Kommissuralaxonen. Das Blockieren von Endoglycan führte ausserdem zu einer Veränderung der Morphologie der Bodenplatte. Während späterer Entwicklungsstadien wird Endoglycan von migrierenden Purkinje- Zellen des Kleinhirns (Cerebellum) exprimiert. Um die Funktion von Endoglycan im Kleinhirn zu untersuchen, haben wir mit ex ovo RNAi eine Methode entwickelt, welche das gezielte Hemmen einzelner Gene während fortgeschrittener Stadien der Entwicklung des Nervensystems ermöglicht. Die neuronale Struktur des Kleinhirns ist gut charakterisiert und daher ein ideales System um verschiedene Entwicklungsschritte des Nervensystems zu studieren. Um die Anwendbarkeit und Effizienz von ex ovo RNAi auf unsere Fragestellung zu testen, haben wir zunächst die Funktion des Zelladhäsionsmoleküls Axonin-1 im Kleinhirn untersucht. Während des Auswachsens der Axone, den so genannten Parallelfasern, exprimieren Körnerzellen Axonin-1. Der Verlust von Axonin-1-Aktivität hat zur Folge, dass die Organisation der Parallelfasern in der Molekularschicht des Kleinhirns defekt ist. Dieser Defekt beruht auf der fehleraften Navigation von Parallelfasern. Den gleichen Effekt auf die Entwicklung der Parallelfasern konnten wir mittels Injektionen von funktionsblockierenden Antikörpern erzielen. Dies deutet darauf hin, dass ex ovo RNAi effizient und reproduzierbar Axonin-1-Aktivität im Kleinhirn hemmen kann. Daher verwendeten wir diese Methode für die Untersuchung von Endoglycan im Kleinhirn. Dieses Gen wird von Purkinje-Zellen während ihrer radialen Migration in Richtung Oberfläche des Kleinhirns exprimiert. Das Fehlen von Endoglycan verursachte einen Migrationsdefekt der Purkinje-Zellen und eine anormale Ausbildung der Purkinje-Zellschicht. Dies wiederum führte zu einer verminderten Dicke der Körnerzellschicht bedingt durch eine Reduktion der Zellteilungsrate.

Abstract

To study gene function in vivo during development of the central nervous system (CNS) efficient model systems that allow for temporal and spatial control of gene expression are required. In our lab, we have used the chicken embryo in combination with in ovo electroporation and RNA interference (RNAi) for gene silencing during early stages of nervous system development. In particular, we used dorsal commissural neurons to study axonal pathfinding. These neurons extend their axons toward the floor plate, the ventral midline of the spinal cord. Guidance cues derived from the floor plate, the intermediate target of these axons, are important for axon growth toward and across the midline. Using in ovo RNAi, we could show that interference with the function of the transmembrane glycoprotein Endoglycan (PODXL2) resulted in the failure to turn or in erroneous caudal turns after midline crossing. Furthermore, the morphology of the floor plate was severely disturbed in the absence of Endoglycan. During later stages of neural development, Endoglycan is expressed by Purkinje cells in the cerebellum. For the functional characterization of Endoglycan during cerebellar development, we extended the experimental accessibility of chicken embryos to much older stages. We established the procedure of ex ovo electroporation and RNAi to manipulate gene expression in the developing cerebellum. The cerebellum represents a well characterized neuronal structure, and therefore, an ideal system to study CNS development, including neurogenesis, differentiation, migration, axon guidance, as well as synapse formation. To demonstrate the applicability and the efficiency of ex ovo RNAi, we analyzed the function of the cell adhesion molecule Axonin-1 in cerebellar development. Axonin-1 is expressed by postmitotic granule cells at the time when they extend their axons, the parallel fibers. In the absence of Axonin-1 the arrangement of granule cell axons within the molecular layer was aberrant and fibers no longer extended parallel but towards the cerebellar surface. The effect of Axonin-1 was not on parallel fiber elongation but affected specifically parallel fiber navigation. The same effects on parallel fiber development observed after ex ovo RNAi were reproduced in embryos treated with function-blocking anti-Axonin-1 antibodies, indicating that ex ovo RNAi efficiently and reproducibly silenced axonin-1 in the developing cerebellum. Thus, we used ex ovo RNAi to study the function of Endoglycan during cerebellar development. Endoglycan is expressed by Purkinje cells at the time when they migrate towards the pial surface to establish the Purkinje cell monolayer. Interference with Endoglycan function caused a severe migration defect of Purkinje cells. Moreover, due to the aberrant formation of the Purkinje cell monolayer, the thickness of the external germinal layer and the proliferation rate of granule cells were significantly reduced causing disturbed foliation and reduced size of the cerebellum. Für die Analyse von Genfunktionen während der Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS) werden effiziente Systeme benötigt, welche es ermöglichen, die Genexpression zeitlich und räumlich zu kontrollieren. In unserem Labor benutzen wir in ovo RNAi (RNA interference), um im Hühnerembryo während früher neuraler Entwicklungsstadien Gene gezielt auszuschalten. Anhand dorsaler Kommissuralneurone studieren wir Wegweisermoleküle, welche Axone zu ihren Zielzellen dirigieren. Axone der Kommissuralneurone wachsen gegen die ventrale Mittelline des Rückenmarks, die Bodenplatte, überqueren diese und wachsen anschliessend in rostraler Richtung weiter. Wegweisermoleküle, welche direkt auf der Bodenplatte lokalisiert sind oder von dieser sezerniert werden, sind wichtig für die korrekte Wegfindung dieser Axone. Mittels in ovo RNAi konnten wir zeigen, dass das Transmembran-Glykoprotein Endoglycan (PODXL2) nach dem Überqueren der Bodenplatte für die anschliessende rostrale Drehung von Kommissuralaxonen wichtig ist. Der Verlust von Endoglycan-Aktivität führte zu Stillstehen am Ausgang der Bodenplatte und fehlerhaftem caudalen Wachsen von Kommissuralaxonen. Das Blockieren von Endoglycan führte ausserdem zu einer Veränderung der Morphologie der Bodenplatte. Während späterer Entwicklungsstadien wird Endoglycan von migrierenden Purkinje- Zellen des Kleinhirns (Cerebellum) exprimiert. Um die Funktion von Endoglycan im Kleinhirn zu untersuchen, haben wir mit ex ovo RNAi eine Methode entwickelt, welche das gezielte Hemmen einzelner Gene während fortgeschrittener Stadien der Entwicklung des Nervensystems ermöglicht. Die neuronale Struktur des Kleinhirns ist gut charakterisiert und daher ein ideales System um verschiedene Entwicklungsschritte des Nervensystems zu studieren. Um die Anwendbarkeit und Effizienz von ex ovo RNAi auf unsere Fragestellung zu testen, haben wir zunächst die Funktion des Zelladhäsionsmoleküls Axonin-1 im Kleinhirn untersucht. Während des Auswachsens der Axone, den so genannten Parallelfasern, exprimieren Körnerzellen Axonin-1. Der Verlust von Axonin-1-Aktivität hat zur Folge, dass die Organisation der Parallelfasern in der Molekularschicht des Kleinhirns defekt ist. Dieser Defekt beruht auf der fehleraften Navigation von Parallelfasern. Den gleichen Effekt auf die Entwicklung der Parallelfasern konnten wir mittels Injektionen von funktionsblockierenden Antikörpern erzielen. Dies deutet darauf hin, dass ex ovo RNAi effizient und reproduzierbar Axonin-1-Aktivität im Kleinhirn hemmen kann. Daher verwendeten wir diese Methode für die Untersuchung von Endoglycan im Kleinhirn. Dieses Gen wird von Purkinje-Zellen während ihrer radialen Migration in Richtung Oberfläche des Kleinhirns exprimiert. Das Fehlen von Endoglycan verursachte einen Migrationsdefekt der Purkinje-Zellen und eine anormale Ausbildung der Purkinje-Zellschicht. Dies wiederum führte zu einer verminderten Dicke der Körnerzellschicht bedingt durch eine Reduktion der Zellteilungsrate.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Stoeckli Esther
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2007
Deposited On:27 Jun 2019 12:12
Last Modified:07 Apr 2020 07:16
Number of Pages:129
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005524969&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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