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Development of a novel dendritic cell targeting vaccine platform based on mouse hepatitis coronavirus multigene RNA vectors


Makia, Ntoh Oscar Divine. Development of a novel dendritic cell targeting vaccine platform based on mouse hepatitis coronavirus multigene RNA vectors. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Die Impfungskampagnen, die zur Ausrottung verschiedener Infektionskrankheiten wie z.B. Pocken oder Poliomyelitis geführt haben, stellen eine der erfolgreichsten Massnahmen im öffentlichen Gesundheitswesen dar. Trotz dieser grossartigen Erfolge auf dem Gebiet der Vakzination, besteht weiterhin dringender Bedarf nach Impfstoffen gegen andere Erkrankungen. Aufgrund des Mangels an wirksamen Vakzinen sterben jährlich Millionen von Menschen an Malaria, Tuberkulose oder HIV. Effiziente Impfstoffe fehlen ebenfalls gegen weitere virale Pathogene, wie das respiratorische Synzitialvirus (RSV) oder das Hepatitis C Virus. Die derzeitigen Impfansätze scheitern bei der Induktion von Immunantworten gegen diese Erreger, da die relevanten Antigene sehr wahrscheinlich nicht an die entsprechenden zellulären Komponenten des Immunsystem geliefert werden. Den wichtigsten Zelltyp in der Immunaktivierungskaskade stellen die dendritischen Zellen (DCs) dar, die darauf spezialisiert sind, prozessierte Peptide den CD4+ und CD8+ T-Zellen zu präsentieren, aber auch mikrobielle Glykolipide für NK-Zellen sichtbar zu machen und native Antigene den B-Zellen zu präsentieren. Daher stellt eine effiziente Belieferung dieser spezialisierten Immunzellen mit Antigenen eine besondere Herausforderung für die Vakzineentwicklung dar. Neben der spezifischen Antigenbeladung, sollten die DCs auch adäquaten Maturationsstimuli ausgesetzt werden, um die vollständige Aktivierungskapazität dieser Zellen zu erhalten. Coronavirus basierte Vektoren sind vielversprechende Werkzeuge, um spezifische Zielzellen mit Antigenen zu beliefern. Diese Viren sind die Grössten der bekannten, positivsträngigen RNA-Viren und stellen eine Klonierungskapazität von 6-9 kb zur Verfügung. Zudem ermöglicht ihre Transkriptionsstrategie die Expression verschiedener Antigene und immunstimulatorischer Zytokine. Die Viren zeigen den weiteren Vorteil, dass sie bevorzugt professionelle Antigen präsentierende Zellen, DCs und Makrophagen, infizieren. Daher war das Hauptziel dieser Arbeit die Entwicklung eines Coronavirus basierten Systems, das den Transport von Antigenstrukturen hin zu Antigen präsentierenden Zellen, bevorzugterweise DCs, in sekundären lymphatischen Organgen gewährleistet. Im Kapital 5.1 dieser Arbeit wird die grundlegende Methodologie für die Generierung von rekombinanter Coronavirus RNA beschrieben. Basierend auf dieser Methodik wurden erste Schritte unternommen, um ein auf dem Maushepatitisvirus (MHV) basierendes System zu etablieren, das die Produktion von Virus ähnlichen Partikels (VLPs) ermöglicht. In Kapitel 5.2 wird eine erste Serie von Experimenten beschrieben, die die Deletion der Strukturproteine E und M des MHV in den Vektorkonstrukten zum Ziel hatten. Eine Verpackungszellinie wurde etabliert, die eine Komplementierung der fehlenden Strukturproteine in trans ermöglichte. Mit Hilfe dieser Zellinie wurde die Produktion von replikationsdefizienten, aber propagierungskompetenten VLPs möglich. Es konnte gezeigt werden, dass MHV-basierte VLPs, die eine Antigenkassette mit GFP exprimieren, primäre DCs in vitro transduzieren können. Da aber eine Produktion von grösseren Mengen von VLPs in diesem Ansatz nicht möglich war, wurde ein Protokoll entwickelt, dass die Generierung von hohen Titern der MHV-basierten VLPs ermöglicht. In Kapital 6.1 wird die Konstruktion eines Satzes von MHV-basierten Vektoren beschrieben, bei denen eine Attenuierung durch die Deletion aller akzessorischen Gene und des Gens für das Strukturprotein E und die funktionelle Ablation des Nichtstrukturproteins nsp1 erreicht wurde. Induzierbare Verpackungszellinien, die das virale Protein E in trans bereitstellen, wurden generiert und grosse Mengen an VLPs konnten mit Hilfe dieser Verpackungszellinien hergestellt werden. Diese VLPs waren stabil über mindestens 12 Passagen und waren propagierungsdefizient in Wildtypzellen. Im Kapitel 6.2 wird das Design einer Serie von VLPs beschrieben, die verschiedene Kombinationen von Transgenen tragen. Das erste Paar dieser VLPs vermittelt die Expression eines Fusionsproteins bestehend aus dem immundominanten Epitop (gp33-KAVYNFATC) des Glykoproteins des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV-GP) und dem grün fluoreszierenden Proteins (GFP), allein oder gemeinsam mit dem immunstimulatorischen Zytokine Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF). Der zweite Satz von Vektoren kodiert für ein humans CTL Epitop des Melan-A Proteins, das mit Hefeubiquitin und GFP fusioniert ist. Auch diese Antigenkassette wurde entweder allein oder zusammen mit GM-CSF verwendet. Effiziente Tranduktion von DCs und Makrophagen mit Vektor vermittelter Antigenexpression in vitro und in vivo konnte demonstriert werden. Einmalige Immunisierung mit Mengen von 104 – 105 pfu führte zu starker und langanhaltender, protektiver, antiviraler und antitumoraler Immunität. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass diese neu entwickelte Vakzineplattform eine Lieferung von Antigenen und immunstimulatorischen Zytokinen zum Wirkort einer erfolgreichen und protektiven Immunanwort ermöglicht.

Abstract

Die Impfungskampagnen, die zur Ausrottung verschiedener Infektionskrankheiten wie z.B. Pocken oder Poliomyelitis geführt haben, stellen eine der erfolgreichsten Massnahmen im öffentlichen Gesundheitswesen dar. Trotz dieser grossartigen Erfolge auf dem Gebiet der Vakzination, besteht weiterhin dringender Bedarf nach Impfstoffen gegen andere Erkrankungen. Aufgrund des Mangels an wirksamen Vakzinen sterben jährlich Millionen von Menschen an Malaria, Tuberkulose oder HIV. Effiziente Impfstoffe fehlen ebenfalls gegen weitere virale Pathogene, wie das respiratorische Synzitialvirus (RSV) oder das Hepatitis C Virus. Die derzeitigen Impfansätze scheitern bei der Induktion von Immunantworten gegen diese Erreger, da die relevanten Antigene sehr wahrscheinlich nicht an die entsprechenden zellulären Komponenten des Immunsystem geliefert werden. Den wichtigsten Zelltyp in der Immunaktivierungskaskade stellen die dendritischen Zellen (DCs) dar, die darauf spezialisiert sind, prozessierte Peptide den CD4+ und CD8+ T-Zellen zu präsentieren, aber auch mikrobielle Glykolipide für NK-Zellen sichtbar zu machen und native Antigene den B-Zellen zu präsentieren. Daher stellt eine effiziente Belieferung dieser spezialisierten Immunzellen mit Antigenen eine besondere Herausforderung für die Vakzineentwicklung dar. Neben der spezifischen Antigenbeladung, sollten die DCs auch adäquaten Maturationsstimuli ausgesetzt werden, um die vollständige Aktivierungskapazität dieser Zellen zu erhalten. Coronavirus basierte Vektoren sind vielversprechende Werkzeuge, um spezifische Zielzellen mit Antigenen zu beliefern. Diese Viren sind die Grössten der bekannten, positivsträngigen RNA-Viren und stellen eine Klonierungskapazität von 6-9 kb zur Verfügung. Zudem ermöglicht ihre Transkriptionsstrategie die Expression verschiedener Antigene und immunstimulatorischer Zytokine. Die Viren zeigen den weiteren Vorteil, dass sie bevorzugt professionelle Antigen präsentierende Zellen, DCs und Makrophagen, infizieren. Daher war das Hauptziel dieser Arbeit die Entwicklung eines Coronavirus basierten Systems, das den Transport von Antigenstrukturen hin zu Antigen präsentierenden Zellen, bevorzugterweise DCs, in sekundären lymphatischen Organgen gewährleistet. Im Kapital 5.1 dieser Arbeit wird die grundlegende Methodologie für die Generierung von rekombinanter Coronavirus RNA beschrieben. Basierend auf dieser Methodik wurden erste Schritte unternommen, um ein auf dem Maushepatitisvirus (MHV) basierendes System zu etablieren, das die Produktion von Virus ähnlichen Partikels (VLPs) ermöglicht. In Kapitel 5.2 wird eine erste Serie von Experimenten beschrieben, die die Deletion der Strukturproteine E und M des MHV in den Vektorkonstrukten zum Ziel hatten. Eine Verpackungszellinie wurde etabliert, die eine Komplementierung der fehlenden Strukturproteine in trans ermöglichte. Mit Hilfe dieser Zellinie wurde die Produktion von replikationsdefizienten, aber propagierungskompetenten VLPs möglich. Es konnte gezeigt werden, dass MHV-basierte VLPs, die eine Antigenkassette mit GFP exprimieren, primäre DCs in vitro transduzieren können. Da aber eine Produktion von grösseren Mengen von VLPs in diesem Ansatz nicht möglich war, wurde ein Protokoll entwickelt, dass die Generierung von hohen Titern der MHV-basierten VLPs ermöglicht. In Kapital 6.1 wird die Konstruktion eines Satzes von MHV-basierten Vektoren beschrieben, bei denen eine Attenuierung durch die Deletion aller akzessorischen Gene und des Gens für das Strukturprotein E und die funktionelle Ablation des Nichtstrukturproteins nsp1 erreicht wurde. Induzierbare Verpackungszellinien, die das virale Protein E in trans bereitstellen, wurden generiert und grosse Mengen an VLPs konnten mit Hilfe dieser Verpackungszellinien hergestellt werden. Diese VLPs waren stabil über mindestens 12 Passagen und waren propagierungsdefizient in Wildtypzellen. Im Kapitel 6.2 wird das Design einer Serie von VLPs beschrieben, die verschiedene Kombinationen von Transgenen tragen. Das erste Paar dieser VLPs vermittelt die Expression eines Fusionsproteins bestehend aus dem immundominanten Epitop (gp33-KAVYNFATC) des Glykoproteins des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV-GP) und dem grün fluoreszierenden Proteins (GFP), allein oder gemeinsam mit dem immunstimulatorischen Zytokine Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF). Der zweite Satz von Vektoren kodiert für ein humans CTL Epitop des Melan-A Proteins, das mit Hefeubiquitin und GFP fusioniert ist. Auch diese Antigenkassette wurde entweder allein oder zusammen mit GM-CSF verwendet. Effiziente Tranduktion von DCs und Makrophagen mit Vektor vermittelter Antigenexpression in vitro und in vivo konnte demonstriert werden. Einmalige Immunisierung mit Mengen von 104 – 105 pfu führte zu starker und langanhaltender, protektiver, antiviraler und antitumoraler Immunität. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass diese neu entwickelte Vakzineplattform eine Lieferung von Antigenen und immunstimulatorischen Zytokinen zum Wirkort einer erfolgreichen und protektiven Immunanwort ermöglicht.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hübscher Ulrich, Ludewig Burkhard
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:09 May 2019 07:58
Last Modified:25 Sep 2019 00:12
Number of Pages:159
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005797609&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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