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Inflammatory Wnt5A signaling in macrophages as novel target for anti-inflammatory action of activated protein C


Vale Duarte Pereira, Claudia Patricia. Inflammatory Wnt5A signaling in macrophages as novel target for anti-inflammatory action of activated protein C. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Bei schwerer systemischer Entzündung und Sepsis finden grundlegende Veränderungen an Komponenten des Gefässsystems statt, insbesondere die entzündliche Aktivierung von Zellen der Gefässwand wie Endothel und glatte Muskelzellen sowie die Aktivierung von Blutzellen wie Monozyten undThrombozyten. Es kommt zur Ausschüttung von entzündungsfördernden Mediatoren wie Stickstoffmonoxid NO, Zytokinen und Chemokinen wie TNFα, IL-1, IL-6, sowie Tissue Factor (TF). Diese Faktoren sind verantwortlich für Blutdruckabfall, Fieber und disseminierte intravasale Gerinnung, was schliesslich zu Schock und Multiorganversagen mit hoher Mortalität führt. Ziel unserer Forschung ist es, die Entzündungsprozesse in den beteiligten vaskulären Zellsystemen zu verstehen und damit Möglichkeiten einer anti-inflammatorischen Intervention aufzuzeigen. Das Hauptziel der vorliegenden Dissertation war es, die Antwort von Blutmonozyten auf inflammatorische Stimulation mit IFNγ in Kombination mit einem mikrobiellen Trigger wie Lipopolysaccharid (LPS) auf transkriptioneller Ebene zu untersuchen, um neue Zielgene für anti-inflammatorische Interventionen mit aktiviertem Protein C (APC) zu finden. APC ist ein körpereigener Gerinnungshemmer mit möglicherweise anti-inflammatorischen Eigenschaften. Durch Analyse des Genexpressionsprofils von entzündlich aktivierten Monozyten konnten wir das gesamte Spektrum von Genen, welche an der Entzündungsantwort beteiligt sind, definieren. Eine funktionelle Clusteranalyse zeigte eine signifikante Ueberrepresentation von entzündungsassoziierten Genen (induzierte Gene) und Genen welche mit Lipidstoffwechselprozessen assoziiert sind (supprimierte Gene). Die anti- inflammatorische Wirkung von APC konnte erstmals in entzündlich aktivierten Monozyten bestätigt werden. Ausserdem konnten wir Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren, welche bisher in Monozyten nicht bekannt waren oder nicht mit Entzündungsprozessen in Verbindung gebracht werden konnten, als Angriffsziele von APC definieren. Unter anderen fanden wir, dass APC den Acetylierungszustand von Histonen moduliert und somit eine Rolle im Chromatinremodeling spielt. Damit wird die Transkription bestimmter Genabschnitte reguliert, die bei einer Entzündungsantwort von Monozyten wichtig sind. Diese Resultate vermitteln ganz neue Einblicke für therapeutische Möglichkeiten bei schwerer systemischer Entzündung und Sepsis. Eines der durch APC am stärksten regulierten Gene ist Wnt5A. In Makrophagen wurde Wnt5A erst kürzlich als ein wichtiger Faktor des durch Toll-Rezeptoren vermittelten inflammatorischen Signalwegs erkannt. Wir sahen, dass Wnt5A durch ein Tollrezeptor vermitteltes Entzündungssignal stark heraufreguliert wird. Wnt5A wiederum induzierte die Gene für die inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-8, und MCP- 1 über einen Ca2+/Calmodulin abhängigen Proteinkinase II (CaMKII ) Signalweg. Dieser Signalweg konnte durch solubles Frizzled-related Peptide 1 (sFRP1), ein lösliches Peptid welches den Wnt5A-Signalweg moduliert, komplett gehemmt werden. Die Tatsache, dass sFRP1 auch die LPS/IFNγ induzierte Phosphorylierung von CaMKII hemmt, deutet auf einen Zusammenhang zwischen entzündungsvermittelter Freisetzung von Wnt5A und LPS/IFNγr induzierter Aktivierung der Makrophagen hin. Wir konnten zeigen, dass die Expression von Wnt5A ein hochkonservierter Vorgang bei der Makrophagenaktivierung ist und ein breites Spektrum von Tollrezeptor- Liganden bei der Auslösung systemischer Entzündungsreaktion beteiligt sind. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die anti-inflammatorisch wirksamen Mediatoren IL-10 und APC diesen Effekt stark beeinflussen. In Seren von Patienten mit schwerer systemischer Entzündung oder septischem Schock fanden wir grosse Mengen immunpräzipitierbares Wnt5A, ein weiterer Hinweis auf eine aktive Rolle von freigesetztem Wnt5A in der Pathophysiologie von systemischen Entzündungsreaktionen bei Sepsis. Dass Wnt5A ein sezerniertes Entzündungsprotein ist und sein Signal durch klassische Rezeptor-Ligand-Interaktion weitergibt, ermöglicht eine Beeinflussung seiner Aktivität in vivo. Eine Möglichkeit hierfür wäre die therapeutische Anwendung löslicher Wnt5A neutralisierender Moleküle, wie wir sie in unserer Arbeit verwendet haben, um den entzündlichen Wnt5A-Signalweg zu hemmen.
During systemic inflammation and sepsis, different components of the vascular system are altered, especially cells of the vessel wall such as endothelium and smooth muscel cells are inflammatory activated, as well as blood cells such as monocytes and platelets. Thereby pro-inflammatory mediators such as nitric oxide NO, cytokines, and chemokines such as TNFα, IL-1, IL-6, and tissue factor were released. These factors are responsible for reduced blood pressure, fever, and disseminated intravasal coagulaton, leading to shock, multiorgan failure and death. The aim of our research is to define the processes involved in the inflammatory response of the vascular cell systems and to find targets for anti-inflammatory intervention. The main goal of this thesis was to study the transcriptional response of monocytes after treatment with inflammatory stimuli (stimulation with interferon (INF) followed by exposure to a microbial trigger like lipopolysaccharide (LPS)) and define new targets for the anti-inflammatory action of activated protein C (APC), an endogenous anti- coagulant with possible anti-inflammatory properties. By gene expression profiling analysis of inflamed macrophages, candidate genes involved in inflammatory responses were defined. Functional clustering of genes significantly regulated by inflammatory stimuli showed a significant overrepresentation of genes involved in the inflammatory response (upregulated genes), and genes associated with lipid metabolic processes (downregulated genes). We were able to confirm the anti- inflammatory action of APC in inflamed macrophages, and define signaling molecules and transcription factors not assigned to inflammatory responses as targets for APC. Among others, we found genes that modulate the acetylation and deacetylation of histone that were regulated by APC, indicating that APC could be involved in chromatine remodeling and thus in transcription regulation of genes that play a role in the inflammatory response of macrophages. These results provide novel insights for therapeutic strategies using APC in systemic inflammation and sepsis. Among the genes most prominently regulated by APC was Wnt5A, a gene that recently emerged to be an important factor for the Toll-mediated inflammatory signaling in macrophages. We have found that Wnt5A was consistently upregulated via Toll-like receptor activation in inflamed monocytes. Wnt5A in turn upregulated expression of the pro-inflammatory genes IL-6, IL-1, IL-8, and MCP-1 via Ca2+- calmodulin–dependent protein kinase II (CaMKII) signaling. This effect was completely abrogated by sFRP1, a soluble modulator of Wnt signaling. Our finding, that sFRP1 also inhibited the LPS/IFN-γ induced CamKII phosphorylation, implied a causal link between Wnt5A secretion triggered by inflammation and LPS/IFN-γ induced macrophage activation. We showed that expression of Wnt5A constitutes a highly conserved response to macrophage activation triggered by a wide array of Toll ligands involved in initiation of systemic inflammation. Attenuation of this effect was achieved by the anti-inflammatory mediators IL-10 and APC. High levels of immunoprecipitatable Wnt5A in sera from patients with severe sepsis provided direct evidence of an active role for secreted Wnt5A in the pathophysiology of the systemic inflammatory response during sepsis. The fact that Wnt5A is a secreted inflammatory protein and that Wnt5A signaling involves classical receptor–ligand interactions raises the possibility of modulation of Wnt5A activity in vivo. Therapeutic application of soluble Wnt5A neutralizing molecules, as applied in our work, thereby represents just one possibility for achieving in vivo suppression of inflammatory Wnt signaling.

Abstract

Bei schwerer systemischer Entzündung und Sepsis finden grundlegende Veränderungen an Komponenten des Gefässsystems statt, insbesondere die entzündliche Aktivierung von Zellen der Gefässwand wie Endothel und glatte Muskelzellen sowie die Aktivierung von Blutzellen wie Monozyten undThrombozyten. Es kommt zur Ausschüttung von entzündungsfördernden Mediatoren wie Stickstoffmonoxid NO, Zytokinen und Chemokinen wie TNFα, IL-1, IL-6, sowie Tissue Factor (TF). Diese Faktoren sind verantwortlich für Blutdruckabfall, Fieber und disseminierte intravasale Gerinnung, was schliesslich zu Schock und Multiorganversagen mit hoher Mortalität führt. Ziel unserer Forschung ist es, die Entzündungsprozesse in den beteiligten vaskulären Zellsystemen zu verstehen und damit Möglichkeiten einer anti-inflammatorischen Intervention aufzuzeigen. Das Hauptziel der vorliegenden Dissertation war es, die Antwort von Blutmonozyten auf inflammatorische Stimulation mit IFNγ in Kombination mit einem mikrobiellen Trigger wie Lipopolysaccharid (LPS) auf transkriptioneller Ebene zu untersuchen, um neue Zielgene für anti-inflammatorische Interventionen mit aktiviertem Protein C (APC) zu finden. APC ist ein körpereigener Gerinnungshemmer mit möglicherweise anti-inflammatorischen Eigenschaften. Durch Analyse des Genexpressionsprofils von entzündlich aktivierten Monozyten konnten wir das gesamte Spektrum von Genen, welche an der Entzündungsantwort beteiligt sind, definieren. Eine funktionelle Clusteranalyse zeigte eine signifikante Ueberrepresentation von entzündungsassoziierten Genen (induzierte Gene) und Genen welche mit Lipidstoffwechselprozessen assoziiert sind (supprimierte Gene). Die anti- inflammatorische Wirkung von APC konnte erstmals in entzündlich aktivierten Monozyten bestätigt werden. Ausserdem konnten wir Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren, welche bisher in Monozyten nicht bekannt waren oder nicht mit Entzündungsprozessen in Verbindung gebracht werden konnten, als Angriffsziele von APC definieren. Unter anderen fanden wir, dass APC den Acetylierungszustand von Histonen moduliert und somit eine Rolle im Chromatinremodeling spielt. Damit wird die Transkription bestimmter Genabschnitte reguliert, die bei einer Entzündungsantwort von Monozyten wichtig sind. Diese Resultate vermitteln ganz neue Einblicke für therapeutische Möglichkeiten bei schwerer systemischer Entzündung und Sepsis. Eines der durch APC am stärksten regulierten Gene ist Wnt5A. In Makrophagen wurde Wnt5A erst kürzlich als ein wichtiger Faktor des durch Toll-Rezeptoren vermittelten inflammatorischen Signalwegs erkannt. Wir sahen, dass Wnt5A durch ein Tollrezeptor vermitteltes Entzündungssignal stark heraufreguliert wird. Wnt5A wiederum induzierte die Gene für die inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-8, und MCP- 1 über einen Ca2+/Calmodulin abhängigen Proteinkinase II (CaMKII ) Signalweg. Dieser Signalweg konnte durch solubles Frizzled-related Peptide 1 (sFRP1), ein lösliches Peptid welches den Wnt5A-Signalweg moduliert, komplett gehemmt werden. Die Tatsache, dass sFRP1 auch die LPS/IFNγ induzierte Phosphorylierung von CaMKII hemmt, deutet auf einen Zusammenhang zwischen entzündungsvermittelter Freisetzung von Wnt5A und LPS/IFNγr induzierter Aktivierung der Makrophagen hin. Wir konnten zeigen, dass die Expression von Wnt5A ein hochkonservierter Vorgang bei der Makrophagenaktivierung ist und ein breites Spektrum von Tollrezeptor- Liganden bei der Auslösung systemischer Entzündungsreaktion beteiligt sind. Wir konnten weiterhin zeigen, dass die anti-inflammatorisch wirksamen Mediatoren IL-10 und APC diesen Effekt stark beeinflussen. In Seren von Patienten mit schwerer systemischer Entzündung oder septischem Schock fanden wir grosse Mengen immunpräzipitierbares Wnt5A, ein weiterer Hinweis auf eine aktive Rolle von freigesetztem Wnt5A in der Pathophysiologie von systemischen Entzündungsreaktionen bei Sepsis. Dass Wnt5A ein sezerniertes Entzündungsprotein ist und sein Signal durch klassische Rezeptor-Ligand-Interaktion weitergibt, ermöglicht eine Beeinflussung seiner Aktivität in vivo. Eine Möglichkeit hierfür wäre die therapeutische Anwendung löslicher Wnt5A neutralisierender Moleküle, wie wir sie in unserer Arbeit verwendet haben, um den entzündlichen Wnt5A-Signalweg zu hemmen.
During systemic inflammation and sepsis, different components of the vascular system are altered, especially cells of the vessel wall such as endothelium and smooth muscel cells are inflammatory activated, as well as blood cells such as monocytes and platelets. Thereby pro-inflammatory mediators such as nitric oxide NO, cytokines, and chemokines such as TNFα, IL-1, IL-6, and tissue factor were released. These factors are responsible for reduced blood pressure, fever, and disseminated intravasal coagulaton, leading to shock, multiorgan failure and death. The aim of our research is to define the processes involved in the inflammatory response of the vascular cell systems and to find targets for anti-inflammatory intervention. The main goal of this thesis was to study the transcriptional response of monocytes after treatment with inflammatory stimuli (stimulation with interferon (INF) followed by exposure to a microbial trigger like lipopolysaccharide (LPS)) and define new targets for the anti-inflammatory action of activated protein C (APC), an endogenous anti- coagulant with possible anti-inflammatory properties. By gene expression profiling analysis of inflamed macrophages, candidate genes involved in inflammatory responses were defined. Functional clustering of genes significantly regulated by inflammatory stimuli showed a significant overrepresentation of genes involved in the inflammatory response (upregulated genes), and genes associated with lipid metabolic processes (downregulated genes). We were able to confirm the anti- inflammatory action of APC in inflamed macrophages, and define signaling molecules and transcription factors not assigned to inflammatory responses as targets for APC. Among others, we found genes that modulate the acetylation and deacetylation of histone that were regulated by APC, indicating that APC could be involved in chromatine remodeling and thus in transcription regulation of genes that play a role in the inflammatory response of macrophages. These results provide novel insights for therapeutic strategies using APC in systemic inflammation and sepsis. Among the genes most prominently regulated by APC was Wnt5A, a gene that recently emerged to be an important factor for the Toll-mediated inflammatory signaling in macrophages. We have found that Wnt5A was consistently upregulated via Toll-like receptor activation in inflamed monocytes. Wnt5A in turn upregulated expression of the pro-inflammatory genes IL-6, IL-1, IL-8, and MCP-1 via Ca2+- calmodulin–dependent protein kinase II (CaMKII) signaling. This effect was completely abrogated by sFRP1, a soluble modulator of Wnt signaling. Our finding, that sFRP1 also inhibited the LPS/IFN-γ induced CamKII phosphorylation, implied a causal link between Wnt5A secretion triggered by inflammation and LPS/IFN-γ induced macrophage activation. We showed that expression of Wnt5A constitutes a highly conserved response to macrophage activation triggered by a wide array of Toll ligands involved in initiation of systemic inflammation. Attenuation of this effect was achieved by the anti-inflammatory mediators IL-10 and APC. High levels of immunoprecipitatable Wnt5A in sera from patients with severe sepsis provided direct evidence of an active role for secreted Wnt5A in the pathophysiology of the systemic inflammatory response during sepsis. The fact that Wnt5A is a secreted inflammatory protein and that Wnt5A signaling involves classical receptor–ligand interactions raises the possibility of modulation of Wnt5A activity in vivo. Therapeutic application of soluble Wnt5A neutralizing molecules, as applied in our work, thereby represents just one possibility for achieving in vivo suppression of inflammatory Wnt signaling.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Sonderegger Peter, Schoedon Gabriele, Fontana Adriano
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:09 May 2019 09:15
Last Modified:25 Sep 2019 00:12
Number of Pages:87
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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