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Identification and characterization of proteins involved in C. elegans EGF-receptor localization


Gutierrez, Peter. Identification and characterization of proteins involved in C. elegans EGF-receptor localization. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Während der Entwicklung von mehrzelligen Organismen reagieren Zellen auf Signale in ihrer Umgebung, welche in das Innere der Zellen geleitet werden und in verschiedene biologische Antworten übersetzt werden, wie zum Beispiel Zellproliferation und Differenzierung. Entwicklungsbiologische Prozesse werden von konservierten, komplexen Signal-Netzwerken reguliert, welche in verschiedenen Modellorganismen studiert werden können. Die Entwicklung des Reproduktionsorganes von C. elegans Hermaphroditen dient als ein etabliertes Modellsystem um diese komplexen Signalwege zu analysieren. Die Vulva der C. elegans Hermaphroditen entsteht aus drei von sechs äquipotenten Vulvavorläuferzellen (P3.p-P8.p). Die Ankerzelle in der Gonade produziert den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), welcher den konservierten EGF-Rezeptor/RAS/MAPK Signalweg in P6.p aktiviert und somit das primäre Zellschicksal ausführt. Um das Signal der Ankerzelle zu empfangen, muss der EGF-Rezeptor in P6.p auf der der Ankerzelle zugewandten basolateralen Plasmamembran lokalisiert sein. Die basolaterale Lokalisierung des EGF- Rezeptors ist essentiell für eine effiziente Aktivierung des Signalweges und somit für die Initiierung der Vulvaentwicklung. Ein Proteinkomplex mit den PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1)- Proteinen LIN-7, LIN-2 und LIN-10 wird für die basolaterale Lokalisierung des EGF- Rezeptors benötigt. Interessanterweise sind PDZ-Proteine oft Adaptoren, welche die subzelluläre Lokalisierung und Aktivität von Plasmamembranproteinen regulieren. Proteine mit FERM (Band 4.1/Ezrin/Radixin/Moesin)-Domänen sind bekannt dafür mit PDZ- Proteinen zu interagieren um gemeinsam die Lokalisierung und die Aktivität von Transmembranproteinen zu regulieren. Mutationen im EGF-Rezeptor, welche zu einer Überexpression, konstitutiver Aktivität oder Misslokalisierung führen, können zum Beispiel zu Krebs führen. Während meiner Doktorarbeit identifizierte und charakterisierte ich zuvor unbekannte Proteine, welche die Lokalisierung des C. elegans EGF-Rezeptors regulieren. Somit war es mir möglich, den Zusammenhang zwischen der Rezeptorlokalisierung und dem Zellschicksal zu erforschen. Ein im Voraus durchgeführter kandidatenbasierter Ansatz mit Hilfe von RNA Interferenz war die Basis für ein Projekt dieser Studie. RNA Interferenz gegen die Gene frm-8 und tag-60 supprimierte den let-60 ras(gf) Multivulva Phänotyp und mislokalisierte den EGF-Rezeptor zu den “Junctions” und intrazellulären Kompartimenten. In dieser Studie wurden die Deletionsmutanten frm-8(zh67) und tag-60(zh93) generiert. Dabei zeigte tag-60(zh93) starke und frm-8(zh67) schwache genetische Interaktionen mit dem EGF-Rezeptor Signalweg. Die Charakterisierung der tag-60(zh93) Mutante zeigte, dass TAG-60 ein neuer Regulator der Vulvaentwicklung sein könnte, welcher im Prozess der EGF-Rezeptor Lokalisierung in den Vulvavorläuferzellen involviert sein könnte. ERM-1 in C. elegans ist das einzige orthologe Protein von Ezrin, Radixin und Moesin in H. sapiens. ERM-1 wurde untersucht, weil es ein potentieller Interaktionspartner von TAG-60 ist. In dieser Studie zeigen wir, dass ERM-1 ein neuartiger Inhibitor der Vulvaentwicklung ist, der möglicherweise die EGF-Rezeptor Lokalisierung an der basolateralen Plasmamembran der Vulvavorläuferzellen reguliert. In einem zweiten Ansatz wurde ein klassischer genetischer Screen für Multivulva Tiere in einem gap-1(ga133) Hintergrund durchgeführt, um entweder Mutanten mit apikal mislokalisiertem EGF-Rezeptor, oder Mutanten von Inhibitoren des EGFR/RAS/MAPK Signalweges zu finden. In diesem Screen wurden zwei fertile Mutanten mit apikal mislokalisiertem EGF-Rezeptor gefunden, welche neue Allele von lin-2 und lin-7 darstellen. Zusätzlich wurden zwei Allele von den zuvor charakterisierten Genen let-19 und gap-3 isoliert. Die Kartierung der zwei verbleibenden Mutanten zh78 und zh95 ist noch nicht abgeschlossen. Die Lokalisierung des EGF-Rezeptors in diesen Mutanten scheint normal zu sein, was darauf hindeutet, dass die Mutationen negative Regulatoren des EGF-Rezeptor Signalweges beeinträchtigen. Um die Kartierung der isolierten Mutanten vom klassischen genetischen Screen zu erleichtern, wurde ein gross angelegter RNAi Screen von den Klonen der Chromosomen I, II und III in einem gap-1(lf) Hintergrund durchgeführt. Sechsunddreissig Kandidatengene wurden gefunden, welche einen synthetischen Multivulva Phänotyp in Kombination mit gap- 1(lf) zeigen. Dabei wurden zuvor charakterisierte negative Regulatoren wie puf-8, fbf-1 und fbf-2, aber auch neue genetische Interaktoren von gap-1 identifiziert. Diese Kandidaten müssen noch genauer analysiert werden und könnten sowohl Regulatoren der EGF-Rezeptor Lokalisierung oder Inhibitoren der Vulvaentwicklung sein. Summary

During the development of multicellular organisms, cells respond to extracellular signals, which are transduced into the cells and result in biological outcomes such as proliferation and differentiation. Developmental processes are controlled by conserved complex signalling networks, which can be studied in model organisms. The development of the egg-laying organ of the C. elegans hermaphrodite serves as a model system, in which these complex signalling cascades can be analyzed. The C. elegans hermaphrodite vulva is formed from the descendants of three out of six equipotent vulval precursor cells (VPCs, P3.p-P8.p). The gonadal anchor cell (AC) produces the epidermal growth factor (EGF) that activates in P6.p the conserved EGF receptor (EGFR)/RAS/MAPK pathway to specify the primary cell fate. In order to receive the AC signal, the EGFR has to be kept on the basolateral surface of the VPCs facing the AC. The basolateral localization of the EGFR is essential for the efficient activation of the RAS/MAPK signalling pathway and consequently for correct vulval induction. A ternary complex formed by the PDZ domain proteins LIN-7, LIN-2 and LIN-10 is required for EGFR localization to the basolateral compartment of the VPCs. Interestingly, PDZ domains are often found in adaptor proteins that regulate the subcellular localization and activity of plasma membrane proteins. Proteins with FERM (Band 4.1/Ezrin/Radixin/Moesin)-domains are known to associate with PDZ-proteins and have been shown to regulate the localization and activity of transmembrane receptors in other model organisms. In humans, mutations in the EGFR that lead to overexpression, constitutive activity or missorting lead to malignancies such as cancer. During my thesis, I identified and characterized novel factors involved in C. elegans EGFR localization and explored the connection of receptor trafficking with cell fate specification. For this purpose, different genetic approaches were used. A candidate-based approach involving RNAi had been used in a preceding screen. RNAi against frm-8 and tag-60 suppressed the let-60 ras(gf) Multivulva phenotype and mislocalized EGFR to the junctional region and to intracellular punctae. In this study, the deletion mutants frm-8(zh67) and tag-60(zh93) were generated, which showed that tag-60(zh93) had strong, and frm-8(zh67) weak genetic interactions with the inductive EGFR signalling pathway. Characterization of the tag-60(zh93) mutants indicated that TAG-60 is a novel regulator of vulval development, which might be involved in EGFR localization in the VPCs. erm-1 is the only ortholog of Ezrin, Radixin and Moesin in C. elegans. ERM-1 was studied because it is a putative binding partner of TAG-60. In this study, we present evidence that ERM-1 is a novel attenuator of vulval development, possibly by regulating the localization of EGFR at the basolateral plasma membrane of the VPCs. In a second approach, a forward genetic screen for synthetic Multivulva animals in a gap-1(lf) background was performed to find mutants that display mislocalized EGFR or mutants in inhibitors of the EGFR/RAS/MAPK pathway. In this screen, we isolated two fertile mutants with apically mislocalized EGFR, which represent novel alleles of lin-2 and lin-7. Additionally, we isolated two alleles of the previously characterized genes let-19 and gap-3. The two remaining mutants zh78 and zh95 are still in the mapping process. EGFR localization seems to be normal in these mutants, indicating that the mutations affect negative regulators of the EGFR pathway. A preliminary genomewide RNAi screen of chromosomes I, II and III in a gap-1(lf) background was performed in order to facilitate the mapping process of the mutants isolated in the forward genetic screen. Thirty-six high confidence candidate genes were found, which showed a synthetic Multivulva phenotype in combination with gap-1(lf). The candidates include not only formerly characterized negative regulators such as puf-8, fbf-1 and fbf-2, but also many novel genetic interactors of gap-1. These candidates have yet to be analyzed in more detail and could either encode regulators of EGFR localization or attenuators of vulval development.

Abstract

Während der Entwicklung von mehrzelligen Organismen reagieren Zellen auf Signale in ihrer Umgebung, welche in das Innere der Zellen geleitet werden und in verschiedene biologische Antworten übersetzt werden, wie zum Beispiel Zellproliferation und Differenzierung. Entwicklungsbiologische Prozesse werden von konservierten, komplexen Signal-Netzwerken reguliert, welche in verschiedenen Modellorganismen studiert werden können. Die Entwicklung des Reproduktionsorganes von C. elegans Hermaphroditen dient als ein etabliertes Modellsystem um diese komplexen Signalwege zu analysieren. Die Vulva der C. elegans Hermaphroditen entsteht aus drei von sechs äquipotenten Vulvavorläuferzellen (P3.p-P8.p). Die Ankerzelle in der Gonade produziert den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), welcher den konservierten EGF-Rezeptor/RAS/MAPK Signalweg in P6.p aktiviert und somit das primäre Zellschicksal ausführt. Um das Signal der Ankerzelle zu empfangen, muss der EGF-Rezeptor in P6.p auf der der Ankerzelle zugewandten basolateralen Plasmamembran lokalisiert sein. Die basolaterale Lokalisierung des EGF- Rezeptors ist essentiell für eine effiziente Aktivierung des Signalweges und somit für die Initiierung der Vulvaentwicklung. Ein Proteinkomplex mit den PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1)- Proteinen LIN-7, LIN-2 und LIN-10 wird für die basolaterale Lokalisierung des EGF- Rezeptors benötigt. Interessanterweise sind PDZ-Proteine oft Adaptoren, welche die subzelluläre Lokalisierung und Aktivität von Plasmamembranproteinen regulieren. Proteine mit FERM (Band 4.1/Ezrin/Radixin/Moesin)-Domänen sind bekannt dafür mit PDZ- Proteinen zu interagieren um gemeinsam die Lokalisierung und die Aktivität von Transmembranproteinen zu regulieren. Mutationen im EGF-Rezeptor, welche zu einer Überexpression, konstitutiver Aktivität oder Misslokalisierung führen, können zum Beispiel zu Krebs führen. Während meiner Doktorarbeit identifizierte und charakterisierte ich zuvor unbekannte Proteine, welche die Lokalisierung des C. elegans EGF-Rezeptors regulieren. Somit war es mir möglich, den Zusammenhang zwischen der Rezeptorlokalisierung und dem Zellschicksal zu erforschen. Ein im Voraus durchgeführter kandidatenbasierter Ansatz mit Hilfe von RNA Interferenz war die Basis für ein Projekt dieser Studie. RNA Interferenz gegen die Gene frm-8 und tag-60 supprimierte den let-60 ras(gf) Multivulva Phänotyp und mislokalisierte den EGF-Rezeptor zu den “Junctions” und intrazellulären Kompartimenten. In dieser Studie wurden die Deletionsmutanten frm-8(zh67) und tag-60(zh93) generiert. Dabei zeigte tag-60(zh93) starke und frm-8(zh67) schwache genetische Interaktionen mit dem EGF-Rezeptor Signalweg. Die Charakterisierung der tag-60(zh93) Mutante zeigte, dass TAG-60 ein neuer Regulator der Vulvaentwicklung sein könnte, welcher im Prozess der EGF-Rezeptor Lokalisierung in den Vulvavorläuferzellen involviert sein könnte. ERM-1 in C. elegans ist das einzige orthologe Protein von Ezrin, Radixin und Moesin in H. sapiens. ERM-1 wurde untersucht, weil es ein potentieller Interaktionspartner von TAG-60 ist. In dieser Studie zeigen wir, dass ERM-1 ein neuartiger Inhibitor der Vulvaentwicklung ist, der möglicherweise die EGF-Rezeptor Lokalisierung an der basolateralen Plasmamembran der Vulvavorläuferzellen reguliert. In einem zweiten Ansatz wurde ein klassischer genetischer Screen für Multivulva Tiere in einem gap-1(ga133) Hintergrund durchgeführt, um entweder Mutanten mit apikal mislokalisiertem EGF-Rezeptor, oder Mutanten von Inhibitoren des EGFR/RAS/MAPK Signalweges zu finden. In diesem Screen wurden zwei fertile Mutanten mit apikal mislokalisiertem EGF-Rezeptor gefunden, welche neue Allele von lin-2 und lin-7 darstellen. Zusätzlich wurden zwei Allele von den zuvor charakterisierten Genen let-19 und gap-3 isoliert. Die Kartierung der zwei verbleibenden Mutanten zh78 und zh95 ist noch nicht abgeschlossen. Die Lokalisierung des EGF-Rezeptors in diesen Mutanten scheint normal zu sein, was darauf hindeutet, dass die Mutationen negative Regulatoren des EGF-Rezeptor Signalweges beeinträchtigen. Um die Kartierung der isolierten Mutanten vom klassischen genetischen Screen zu erleichtern, wurde ein gross angelegter RNAi Screen von den Klonen der Chromosomen I, II und III in einem gap-1(lf) Hintergrund durchgeführt. Sechsunddreissig Kandidatengene wurden gefunden, welche einen synthetischen Multivulva Phänotyp in Kombination mit gap- 1(lf) zeigen. Dabei wurden zuvor charakterisierte negative Regulatoren wie puf-8, fbf-1 und fbf-2, aber auch neue genetische Interaktoren von gap-1 identifiziert. Diese Kandidaten müssen noch genauer analysiert werden und könnten sowohl Regulatoren der EGF-Rezeptor Lokalisierung oder Inhibitoren der Vulvaentwicklung sein. Summary

During the development of multicellular organisms, cells respond to extracellular signals, which are transduced into the cells and result in biological outcomes such as proliferation and differentiation. Developmental processes are controlled by conserved complex signalling networks, which can be studied in model organisms. The development of the egg-laying organ of the C. elegans hermaphrodite serves as a model system, in which these complex signalling cascades can be analyzed. The C. elegans hermaphrodite vulva is formed from the descendants of three out of six equipotent vulval precursor cells (VPCs, P3.p-P8.p). The gonadal anchor cell (AC) produces the epidermal growth factor (EGF) that activates in P6.p the conserved EGF receptor (EGFR)/RAS/MAPK pathway to specify the primary cell fate. In order to receive the AC signal, the EGFR has to be kept on the basolateral surface of the VPCs facing the AC. The basolateral localization of the EGFR is essential for the efficient activation of the RAS/MAPK signalling pathway and consequently for correct vulval induction. A ternary complex formed by the PDZ domain proteins LIN-7, LIN-2 and LIN-10 is required for EGFR localization to the basolateral compartment of the VPCs. Interestingly, PDZ domains are often found in adaptor proteins that regulate the subcellular localization and activity of plasma membrane proteins. Proteins with FERM (Band 4.1/Ezrin/Radixin/Moesin)-domains are known to associate with PDZ-proteins and have been shown to regulate the localization and activity of transmembrane receptors in other model organisms. In humans, mutations in the EGFR that lead to overexpression, constitutive activity or missorting lead to malignancies such as cancer. During my thesis, I identified and characterized novel factors involved in C. elegans EGFR localization and explored the connection of receptor trafficking with cell fate specification. For this purpose, different genetic approaches were used. A candidate-based approach involving RNAi had been used in a preceding screen. RNAi against frm-8 and tag-60 suppressed the let-60 ras(gf) Multivulva phenotype and mislocalized EGFR to the junctional region and to intracellular punctae. In this study, the deletion mutants frm-8(zh67) and tag-60(zh93) were generated, which showed that tag-60(zh93) had strong, and frm-8(zh67) weak genetic interactions with the inductive EGFR signalling pathway. Characterization of the tag-60(zh93) mutants indicated that TAG-60 is a novel regulator of vulval development, which might be involved in EGFR localization in the VPCs. erm-1 is the only ortholog of Ezrin, Radixin and Moesin in C. elegans. ERM-1 was studied because it is a putative binding partner of TAG-60. In this study, we present evidence that ERM-1 is a novel attenuator of vulval development, possibly by regulating the localization of EGFR at the basolateral plasma membrane of the VPCs. In a second approach, a forward genetic screen for synthetic Multivulva animals in a gap-1(lf) background was performed to find mutants that display mislocalized EGFR or mutants in inhibitors of the EGFR/RAS/MAPK pathway. In this screen, we isolated two fertile mutants with apically mislocalized EGFR, which represent novel alleles of lin-2 and lin-7. Additionally, we isolated two alleles of the previously characterized genes let-19 and gap-3. The two remaining mutants zh78 and zh95 are still in the mapping process. EGFR localization seems to be normal in these mutants, indicating that the mutations affect negative regulators of the EGFR pathway. A preliminary genomewide RNAi screen of chromosomes I, II and III in a gap-1(lf) background was performed in order to facilitate the mapping process of the mutants isolated in the forward genetic screen. Thirty-six high confidence candidate genes were found, which showed a synthetic Multivulva phenotype in combination with gap-1(lf). The candidates include not only formerly characterized negative regulators such as puf-8, fbf-1 and fbf-2, but also many novel genetic interactors of gap-1. These candidates have yet to be analyzed in more detail and could either encode regulators of EGFR localization or attenuators of vulval development.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hajnal Alex, Gotta Monica
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:10 May 2019 14:08
Last Modified:25 Sep 2019 00:12
Number of Pages:170
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod005885741&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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