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Investigations on phosphospecific interactions in the DNA damage response


Bonalli, Mario-Emanuel. Investigations on phosphospecific interactions in the DNA damage response. 2009, University of Zurich, Vetsuisse Faculty.

Abstract

Double strand breaks (DSBs) are one of the most dangerous forms of DNA damage. A globular cellular response is activated upon induction of DSBs. Mediator of DNA damage checkpoint 1 (MDC1) is one of those proteins involved in the DNA damage response (DDR) that contains an N-terminal forkhead associated (FHA) domain and a tandem BRCA1 C-terminal (BRCT) domain. MDC1 is recruited to sites of DNA damage upon phosphorylation of variant histone 2A (H2AX) by the kinase ataxia telangiectasia mutated (ATM). In order to identify the amino acids that are targeted by ATM, we took a candidate approach and mutated a Threonine residue at the N-terminus of MDC1 to Alanin. We then performed an ATM kinase assay using radioactive ATP in order to check whether the T4A mutant fragment was still phosphorylated by ATM. Results of this study clearly revealed that ATM phosphorylates Thr 4 in MDC1 in vitro. We suggest that Thr4 is the major ATM phosphorylation site within the N-terminus of MDC1. In a second part of this work, we sought to develop a proteomics approach to identify novel components of the DDR. We set up a tandem affinity purification (TAP) system using the BRCA1-BRCT domains fused to enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) and triple-tagged at the C-terminus by a Streptavidin-binding peptide (Strep-tag II) a Flag-tag and an S-tag. As the Strep-tag II did not efficiently bind to Streptavidin, the performance of a TAP was not successful.

DNS Doppelstrangbrüche (DSB) gehören zu den gefährlichsten DNS Schäden und führen zu einer weitgreifenden zellulären Antwort. Mediator of DNA damage checkpoint 1 (MDC1) ist ein Protein dieser DNA damage response (DDR) und besitzt eine N-terminale FHA als auch eine C-terminale tandem BRCT Domäne. MDC1 wird als Folge der Phosphorylierung von variant Histone 2A (H2AX) durch die Kinase Ataxia Telangiectasia mutated (ATM) zum Ort eines DNS Schadens rekrutiert. Um die von ATM phosphorylierte Aminosäure zu identifizieren, wurde Thr4 als potentieller Kandidat zu Ala ummutiert. Mit radioaktivem ATP wurde ein ATM- Kinase Assay durchgeführt um herauszufinden ob das T4A mutierte Fragment immer noch phosphoryliert wird. Die Ergebnisse zeigten, dass T4A von ATM in vitro phosphoryliert wird. Folglich ist T4 die einzige ATM Phosphorylierungsstelle am N- Terminus von MDC1. In einem zweiten Teil entschieden wir uns ein Proteomicsverfahren zu etablieren um neue Komponenten der DDR zu identifizieren. Wir entwickelten eine Tandem Affinity Purification (TAP), bestehend aus der BRCA1 BRCT Domäne verbunden mit dem enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) und einem Trippel-tag am C-Terminus gebildet von einem Streptavidin-bindenden Peptid (Strep-tag II), einem Flag-tag und einem S-tag. Da der Strep-tag II nicht effizient von Streptavidin gebunden wurde, blieb die Durchführung der TAP erfolglos.

Abstract

Double strand breaks (DSBs) are one of the most dangerous forms of DNA damage. A globular cellular response is activated upon induction of DSBs. Mediator of DNA damage checkpoint 1 (MDC1) is one of those proteins involved in the DNA damage response (DDR) that contains an N-terminal forkhead associated (FHA) domain and a tandem BRCA1 C-terminal (BRCT) domain. MDC1 is recruited to sites of DNA damage upon phosphorylation of variant histone 2A (H2AX) by the kinase ataxia telangiectasia mutated (ATM). In order to identify the amino acids that are targeted by ATM, we took a candidate approach and mutated a Threonine residue at the N-terminus of MDC1 to Alanin. We then performed an ATM kinase assay using radioactive ATP in order to check whether the T4A mutant fragment was still phosphorylated by ATM. Results of this study clearly revealed that ATM phosphorylates Thr 4 in MDC1 in vitro. We suggest that Thr4 is the major ATM phosphorylation site within the N-terminus of MDC1. In a second part of this work, we sought to develop a proteomics approach to identify novel components of the DDR. We set up a tandem affinity purification (TAP) system using the BRCA1-BRCT domains fused to enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) and triple-tagged at the C-terminus by a Streptavidin-binding peptide (Strep-tag II) a Flag-tag and an S-tag. As the Strep-tag II did not efficiently bind to Streptavidin, the performance of a TAP was not successful.

DNS Doppelstrangbrüche (DSB) gehören zu den gefährlichsten DNS Schäden und führen zu einer weitgreifenden zellulären Antwort. Mediator of DNA damage checkpoint 1 (MDC1) ist ein Protein dieser DNA damage response (DDR) und besitzt eine N-terminale FHA als auch eine C-terminale tandem BRCT Domäne. MDC1 wird als Folge der Phosphorylierung von variant Histone 2A (H2AX) durch die Kinase Ataxia Telangiectasia mutated (ATM) zum Ort eines DNS Schadens rekrutiert. Um die von ATM phosphorylierte Aminosäure zu identifizieren, wurde Thr4 als potentieller Kandidat zu Ala ummutiert. Mit radioaktivem ATP wurde ein ATM- Kinase Assay durchgeführt um herauszufinden ob das T4A mutierte Fragment immer noch phosphoryliert wird. Die Ergebnisse zeigten, dass T4A von ATM in vitro phosphoryliert wird. Folglich ist T4 die einzige ATM Phosphorylierungsstelle am N- Terminus von MDC1. In einem zweiten Teil entschieden wir uns ein Proteomicsverfahren zu etablieren um neue Komponenten der DDR zu identifizieren. Wir entwickelten eine Tandem Affinity Purification (TAP), bestehend aus der BRCA1 BRCT Domäne verbunden mit dem enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) und einem Trippel-tag am C-Terminus gebildet von einem Streptavidin-bindenden Peptid (Strep-tag II), einem Flag-tag und einem S-tag. Da der Strep-tag II nicht effizient von Streptavidin gebunden wurde, blieb die Durchführung der TAP erfolglos.

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Other titles:Untersuchung phosphospezifischer Interaktionen in der DNA damage response
Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hübscher Ulrich, Riediger Thomas
Communities & Collections:05 Vetsuisse Faculty > Institute of Veterinary Physiology
05 Vetsuisse Faculty > Department of Molecular Mechanisms of Disease
07 Faculty of Science > Department of Molecular Mechanisms of Disease

UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:570 Life sciences; biology
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:07 Feb 2019 10:39
Last Modified:15 Apr 2021 15:00
Number of Pages:79
OA Status:Green

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