Structural and functional studies on AcrB, a bacterial multidrug efflux pump and homologue of Niemann-Pick C1 protein

Abstract

Antibiotic resistance of pathogenic bacteria is an emerging threat to global public health. The increased tolerance to antimicrobial drugs is mainly due to the efflux of these substrates out of bacterial cells mediated by multidrug resistance (MDR) transporters. In Gram-negative bacteria such as Escherichia coli or Pseudomonas aeruginosa, highly effective tripartite multidrug efflux systems extrude a large variety of noxious substrates from the cell interior or the inner membrane directly into the medium. In E. coli, the major multidrug efflux pump is the tripartite AcrA/AcrB/TolC complex, which extrudes structurally and functionally diverse chemical compounds. This complex is composed of the outer membrane factor (OMF) TolC spanning the outer membrane and protruding 100 Å into the periplasmic space. The membrane fusion protein (MFP) AcrA links the proximal end of TolC with the periplasmic domain of the inner membrane component AcrB. The latter protein belongs to the resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily of transport proteins and is both the substrate specificity determinant and the energy module of the AcrA/AcrB/TolC efflux system. While in prokaryotes the main physiological function of RND proteins is associated with extrusion of noxious substrates, they seem to be involved in lipid homeostasis and cell morphogenesis in eukaryotic cells. One of the most intensively studied human RND proteins is Niemann-Pick C1, which is engaged in salvage of lipids from the endosomal/lysosomal pathway. Recently, an asymmetric structure of AcrB in which the monomers adopt the three different conformations called loose, tight and open was determined. Binding of the substrates minocyclin and doxorubicin to a hydrophobic pocket in the periplasmic domain of the tight conformer was observed. In the loose and tight state, tunnels lead from a lateral periplasmic entrance towards the location of the binding pocket, while in the open conformer, this pocket is exclusively connected via another tunnel to a funnel at the centre of the AcrB trimer ultimately leading towards the TolC channel. The current hypothesis states that transport of substrate is accomplished by functional rotation, meaning that each monomer cycles in a connected and concerted fashion from the loose to tight to open conformation and back to the loose conformation in analogy to the functional rotation of the catalytic β-subunit observed in the F1Fo 3 ATPase. Since AcrB is driven by the proton motive force, the energy conversion to drive the large conformational changes observed in the periplasmic domain is considered to be generated by protonation and deprotonation of essential charged residues residing in the transmembrane domain. In my PhD thesis, the focus was on the binding of substrate to the hydrophobic pocket and on the translocation of protons through the transmembrane domain, which was analyzed by structural and functional experiments with wild-type and mutant AcrB. Substitution of the binding pocket residue F610 with alanine resulted in E. coli mutants with an impaired phenotype for all the substrate tested, whereas the binding pocket residue V612 to phenylalanine conversion changed the substrate specificity of the V612F mutant including an increased resistance towards linezolid. Crystallization of the V612F variant in the presence and absence of Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) and subsequent X-ray crystallography revealed that AcrB_V612F comprises a novel conformation in which each of the monomers were present in the tight state. The “all-tight” conformation observed for AcrB_V612F is postulated to be adopted by wild-type AcrB during functional rotation as well, for example when the concentration of substrate is high. To shed light on the protonation and deprotonation events in the transmembrane domain, four essential charged residues D407, D408, K940 and R971 - also referred to as proton relay network - as well as the important polar residue T978 were substituted with asparagine (D407, D408) or with alanine (K940, R971, T978) and the structures of both wild-type and mutant AcrB/DARPin complexes were determined at a resolution of 2.0-3.0 Å. The most prominent differences between wild-type and mutant protein were observed in the tight conformation near the proton relay network. Here, the AcrB_D407N and AcrB_R971A mutant exhibited structural features that are typical for the open conformer, implying that the structure of these mutant proteins might resemble intermediate conformations at different steps during the transition from tight to the open state. Additionally, we identified water molecules in the transmembrane domain that exhibit distinct positions in the three monomers. Based on these high resolution structural information, a putative pathway for protons through the transmembrane domain from the periplasm to the cytoplasm is proposed, and a detailed model for protonation and deprotonation events during functional rotation is presented.
Die Verbreitung von antibiotikaresistenten pathogenen Bakterien ist eine zunehmende Gefahr für die weltweite Gesundheit. Erhöhte Toleranz gegenüber multiplen antibakteriellen Substanzen wird hauptsächlich durch sogenannte „multidrug resistance“ Transportproteine verursacht, welche verschiedenste toxische Stoffe aus der bakteriellen Zelle befördern. In Gram-negativen Bakterien wie zum Beispiel Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa transportieren dreiteilige Effluxsysteme äusserst effektiv eine Vielzahl von schädlichen Substanzen entweder aus dem Zellinnern oder von der inneren Membran direkt ins umgebende Medium. Das wichtigste „multidrug“ Transportsystem in E. coli ist der dreiteilige AcrA/AcrB/TolC-Komplex, welcher strukturell und funktionell verschiedenste Chemikalien transportiert. Dieser Komplex besteht aus dem „Outer Membrane Factor (OMF)“ TolC, welcher die äussere Membran durchdringt und 100 Å weit ins Periplasma ragt; der inneren Membrankomponente AcrB, ein trimeres Transportprotein der „Resistance-Nodulation-cell Division (RND)“ Superfamilie, welches die Substratsdeterminante und das Energiemodul des gesamten AcrA/AcrB/TolC-Komplexes darstellt; und des „Membrane Fusion Protein (MFP)“ AcrA, welches das proximale Ende von TolC mit der periplasmatischen Domäne von AcrB verbindet. Während die RND Proteine in Prokaryoten hauptsächlich mit dem Export von schädlichen Stoffen in Verbindung gebracht werden, scheinen sie in Eukaryoten in Lipid-Homöostase und Zellmorphogenese involviert zu sein. Eines der am intensivsten untersuchten menschlichen RND Proteine ist Niemann-Pick C1, welches am „salvage-pathway“ von Lipiden aus dem endosomal/lysosomalen System beteiligt ist. Kürzlich wurde eine asymmetrische Struktur von trimerem AcrB bestimmt, in welchem die Monomere die drei Konformationen „loose“, „tight“ und „open“ einnehmen. Des weiteren konnte die Bindung der Substrate Minocyclin und Doxorubicin in einer hydrophoben Bindungstasche in der periplasmatischen Domäne des „tight“ Konformers nachgewiesen werden. Im „loose“ und „tight“ Zustand führen Tunnel von einem periplasmatisch lokalisierten lateralen Eingang zur Position der Bindungstasche, während im „open“ Konformer ein neuer Tunnel diese Stelle mit einem Ausgangstrichter verbindet, welcher sich in der Mitte der drei Monomere befindet und zum TolC Kanal führt. Gemäss der aktuellen Hypothese wird der Transport von Substraten durch funktionelle Rotation bewerkstelligt: analog zur funktionellen Rotation der katalytischen β-Untereinheit der F1Fo-ATPase nimmt jeder der drei Monomere in einer abgestimmten Art und Weise nacheinander die Zustände „loose“, „tight“ und „open“ an. Es wird angenommen, dass in AcrB, welches durch die protonenmotorische Kraft angetrieben wird, titrierbare Aminosäurereste in der Transmembrandomäne protoniert und deprotoniert werden. Dadurch würden die grossen konformationellen Änderungen in der periplasmatischen Domäne energetisiert, welche zu Substrattransport führten. Der Fokus meiner Doktorarbeit war auf die Bindung von Substraten in der periplasmatischen AcrB-Bindungstasche und auf die Translokation von Protonen durch die Transmembrandomäne gerichtet. Dafür wurde wildtyp und mutiertes AcrB funktionell und strukturell untersucht. Die Alanin-Substitution von F610, welches sich in der Bindungstasche befindet, führte zu einem eingeschränkten Transport für alle getesteten Substrate, während die V612F Punktmutation spezifisch die Substratspezifität von AcrB veränderte: gegenüber den meisten Substraten wurde die in E. coli gemessene Resistenz zwar erniedrigt, die Toleranz gegenüber Linezolid jedoch spezifisch erhöht. Röntgenstruktur-Analysen der AcrB Variante V612F mit und ohne „Designed Ankyrin Repeat Proteins“ (DARPins) zeigten das Transportprotein in einer neuen Konformation, in welcher alle Monomere den „tight“ Zustand einnahmen. Es wird postuliert, dass während der funktionellen Rotation die „all-tight“ Konformation auch in wildtyp AcrB vorkommt, zum Beispiel bei hoher Substratkonzentration. Um Protonierungs- und Deprotonierungsereignisse in der Transmembrandomäne zu untersuchen, wurde das sogenannte „proton relay network“, bestehend aus den vier essentiellen und titrierbaren Aminosäureresten D407, D408, K940 und R971, und der funktionell wichtige polare Aminosäurerest T978 durch Asparagin (D407, D408) oder durch Alanin (K940, R971, T978) ersetzt und die Strukturen von wildtyp und mutanten AcrB/DARPin-Komplexen bei einer Auflösung von 2.0 bis 3.0 Å bestimmt. Die auffallendste Unterschiede zwischen dem Wildtyp und den mutierten AcrB Varianten wurden im „tight“ Konformer nahe des „proton relay network“ beobachtet: AcrB_D407N und AcrB_R971A wiesen strukturelle Eigenschaften sowohl des „tight“ wie auch des „open“ Monomers auf. Möglicherweise repräsentieren diese Strukturen unterschiedlich weit fortgeschrittene Intermediate während der Konversion vom „tight“ zum „open“ Konformer. Zusätzlich identifizierten wir in der Transmembrandomäne Wassermolekülen, welche in den drei Konformationen unterschiedliche Positionen aufwiesen. Basierend auf diesen hochauflösenden Strukturinformationen wird ein möglicher Weg der Protonen durch die Transmembrandomäne vom Periplasma ins Zytoplasma vorgeschlagen und ein detailliertes Modell der Protonierungs- und Deprotonierungsereignisse während der funktionellen Rotation präsentiert.