Abstract
The lysosomes form a crucial cellular compartment which degrades cellular wastes, and recycles the digested parts for the biosynthesis of new components. The biological importance of the lysosomes for the cell as well as for the entire organism is best illustrated by the fact that the disturbance of lysosomal functions leads to severe metabolic diseases such as mucolipidosis, Gaucher’s disease or Niemann-Pick’s disease. The cation-dependent mannose 6-phosphate receptor sustains lysosomal function by redirecting newly synthesized lysosomal enzymes from the secretion pathway to the lysosomes. To fulfill this task, the cation-dependent mannose 6- phosphate receptor captures lysosomal enzymes within the trans-Golgi network, transports them to endosomes where the enzymes are released, and recycles back to the trans-Golgi network for a new round of sorting. The proper sorting of the receptor within endosomes is crucial to avoid the aberrant transport of the receptor to lysosomes where it would be degraded. Interestingly, the post-translational modification S- palmitoylation has previously been shown to be essential for the proper sorting of the receptor in endosomes. In addition, a protein acyl transferase activity for the cation- dependent mannose 6-phosphate receptor has been found to exist at the plasma membrane and in endosomes. In this work, we studied two post-translational modifications (i.e. S-palmitoylation and ubiquitination) and their role for the correct sorting of the cation-dependent mannose 6- phosphate receptor within endosomes. It is shown that the receptor ubiquitinated on its cytosolic tail, and we give evidence that this modification is part of a quality control mechanism occurring at the plasma membrane and endosomes. In addition, it was demonstrated in this work that S-palmitoylation allows the association of the receptor with cholesterol rich membrane sub-domains which most probably are localized in early endosomes. With the knowledge that cholesterol rich membrane sub-domains are important for the retrieval of the cation-dependent mannose 6-phosphate receptor from the endosomes to the trans-Golgi network, S-palmitoylation appears to be a molecular switch which allows the association of the receptor with cholesterol rich membrane sub- domains in endosomes to promote its retrieval to the trans-Golgi network. In order to identify the enzyme catalyzing the S-palmitoylation of the cation-dependent mannose 6- phosphate receptor, a new family of protein acyl-transferases (the ZDHHC protein family) was analyzed. Consequently, a new phylogeny of ZDHHC protein family was established, the intracellular localization of individual ZDHHC proteins was determined, and their enzymatic activity for the cation-dependent mannose 6-phosphate receptor was analyzed. As a result of this PhD work, a new model for the trafficking of the cation-dependent mannose 6-phosphate receptor within endosomes is proposed, and a restricted number of ZDHHC proteins are identified as putative protein acyl-transferases for the cation- dependent mannose 6-phosphate receptor. In addition, the phylogenetic analysis of the ZDHHC protein family revealed groups of ZDHHC proteins with a close evolutionary origin. It was shown experimentally that several ZDHHC proteins share similar protein substrates. Interestingly, using our phylogenetic classification, we found that these ZDHHC proteins are also classified within the same phylogenetic group. Therefore, it seems that ZDHHC proteins that are evolutionary closely related have overlapping protein substrate specificities, which might provide important indications to study the remaining ZDHHC proteins that have not been characterized yet.
Lysosomen bilden ein wichtiges Zellkompartiment, welches zelluläre Abfallstoffe abbaut und die dabei frei werdenden Fragmente für die Biosynthese neuer Verbindungen von der Zelle verwendet werden können. Die essentielle Bedeutung der Lysosomen - sowohl für die Zelle als auch für den gesamten Organismus - wird durch die Tatsache verdeutlicht, dass Beeinträchtigungen der lysosomalen Funktionen zu schweren metabolischen Erkrankungen, wie zum Beispiel Mucolipidosen, Gaucher Syndrom und Niemann-Pick Syndrom, führen können. Der 'cation-dependent mannose 6-phosphate' Rezeptor erhält die Funktion der Lysosomen aufrecht, indem er neu synthetisierte lysosomale Enzyme vom sekretorischen Transportweg abbringt und sie in die Lysosomen transportiert. Zur Erfüllung dieser Aufgabe bindet der 'cation-dependent mannose 6-phosphate' Rezeptor die lysosomalen Enzyme innerhalb des trans-Golgi Netzwerks und transportiert sie zu den Endosomen, wo er sie freigibt. Anschliessend begibt er sich zurück zum trans-Golgi Netzwerk, um eine neue Runde des Transports zu beginnen. Das korrekte Sortieren des Rezeptors in den Endosomen ist entscheidend, um einen irrtümlichen Transport des Rezeptors in die Lysosomen zu verhindern, wo er abgebaut würde. Interessanterweise konnte in einer früheren Arbeit gezeigt werden, dass die post-translationale Modifikation durch S-Palmitoylierung essentiell für das korrekte Sortieren des Rezeptors in den Endosomen ist. Zudem konnte in der Plasmamembran und in den Endosomen eine Protein-Acyl-Transferase- Aktivität für den 'cation-dependent mannose 6-phosphate' Rezeptor gefunden werden. In dieser Dissertation wurden zwei post-translationale Modifikationen (die S- Palmitoylierung und die Ubiquitinierung) und deren Rollen für das korrekte Sortieren des 'cation-dependent mannose 6-phosphate' Rezeptors in den Endosomen untersucht. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor an seinem cytosolischen Ende ubiquitiniert wird. Zudem wurde dargestellt Belege gegeben, dass diese Modifikation Teil eines Qualitätskontroll-Mechanismus auf Ebene der Plasmamembran und der Endosomen sein könnte. Des Weiteren wird in dieser Arbeit aufgezeigt, dass die S-Palmitoylierung die Assoziation des Rezeptors mit cholesterin-reichen Membrandomänen ermöglicht, welche sehr wahrscheinlich in frühen Endosomen lokalisiert sind. Diese cholesterin- reichen Membrandomänen werden für den Rücktransport des 'cation-dependent mannose 6-phosphate' Rezeptors von den Endosomen zum trans-Golgi Netzwerk gebraucht. Somit scheint die S-Palmitoylierung ein molekularer Schalter zu sein, welcher die Assoziation des Rezeptors mit cholesterin-reichen Membrandomänen in Endosomen und somit dessen Rücktransport zum trans-Golgi Netzwerk erlaubt. Um das Enzym, welches die S-Palmitoylierung des 'cation-dependent mannose 6- phosphate' Rezeptors katalysiert, identifizieren zu können, wurde eine neue Familie von Protein-Acyl-Transferasen (die ZDHHC Proteinfamilie) untersucht. In der Folge wurde eine neue Phylogenese der ZDHHC Proteinfamilie aufgestellt, die intrazelluläre Lokalisation der einzelnen ZDHHC Proteine bestimmt und deren enzymatische Aktivität für den 'cation-dependent mannose 6-phosphate' Rezeptor analysiert. Als Resultat dieser Dissertation kann ein neues Model für den Transport des 'cation-dependent mannose 6-phosphate' Rezeptors innerhalb der Endosomen aufgestellt werden. Des Weiteren werden eine limitierte Zahl an ZDHHC Proteinen als mutmassliche Protein- Acyl-Transferasen für den 'cation-dependent mannose 6-phosphate' Rezeptor identifiziert. Die phylogenetische Analyse der ZDHHC Proteinfamilie offenbarte zudem Gruppen von ZDHHC Proteinen mit einem nahen evolutionären Ursprung. Es konnte experimentell gezeigt werden, dass mehrere ZDHHC Proteine ähnliche Protein- Substrate besitzen. Interessanterweise waren diese Proteine denn auch unter Anwendung unserer phylogenetischen Klassifikation in der selben phylogenetischen Gruppe eingeordnet worden. Es scheint deshalb, dass evolutionär nahe miteinander verwandte ZDHHC Proteine überlappende Proteinsubstrat-Spezifitäten besitzen. Dieses Wissen liefert wertvolle Hinweise für die Untersuchung der verbleibenden, noch nicht charakterisierten ZDHHC Proteine.
Filippi, Bruno Guy Henri