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Characterization of repulsive slit / Robo signalling in neural crest cell : migration and sensory axon guidance in the chicken embryo


Debrunner, Marc. Characterization of repulsive slit / Robo signalling in neural crest cell : migration and sensory axon guidance in the chicken embryo. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Extracellular Slits and their transmembrane receptors, the Robos, represent a well characterized repulsive guidance system which is involved in different processes of axon guidance and migration of cells in invertebrates and vertebrates. In my dissertation, we dissected the role of Slits and Robos in axon guidance of sensory and motoneurons and their involvement in early neural crest cell migration. Robo1 and Robo2 are expressed in migrating neural crest cells, DRGs, motoneurons and interneurons of the spinal cord. Robo3 is only expressed in interneurons of the spinal cord. Slits are expressed along the migratory path of neural crest cells and the trajectories of sensory and motor axons. Downregulation of Robo1, Robo2 and members of the Slit family led to ectopic neural crest cells within the posterior part of the sclerotome and the dermomyotome and to perturbed formation of DRGs, dorsal roots and peripheral sensory branches as well as motoneurons. The metameric segregation was disturbed, DRGs and dorsal roots were elongated and fused and peripheral branches defasciculated. Overexpression of human and mouse Slits resulted in smaller DRGs and in the almost complete lack of dorsal roots and peripheral sensory branches as well as motoneurons. All three Slits strongly repelled DRG neurites in vitro and in vivo. Furthermore, we analysed the targeting of a subpopulation of nociceptive and proprioceptive sensory collaterals using Fast DiI as a tracer. Nociceptive collaterals showed pathfinding errors in embryos with impaired Robo1, Robo2, Slit1 and Slit3. Proprioceptive collaterals were severely affected only in Slit3 deficient embryos. Boundary cap cell clustering at the DREZ was affected in Robo1, Robo2 and Slit1-3 deficient embryos. The clusters were not properly segregated and aligned at the DREZ in the anterior and posterior somitic compartment. Thus, my results provide new insight in the function of Slit / Robo signalling in neural crest cell migration and in the development of the peripheral nervous system.

Slits, extrazellulär sezernierte Glykoproteine, und ihre Transmembranrezeptoren, die Robos (Roundabouts), spielen eine wichtige Rolle als Wegweisermoleküle während der Entwicklung des peripheren und zentralen Nervensystems in Wirbellosen und Wirbeltieren und sind meistens hoch konserviert zwischen den Spezies. Die Familie der Robos setzt sich aus vier Proteinen zusammen, genannt Robo1-4. Drei Slit Gene wurden identifiziert. Die genaue Analyse ihrer Expressionsmuster in Hühnerembryonen zwischen dem Hamburger / Hamilton Stadium 14 und Stadium 42 weist darauf hin, dass Slits und Robos für die Wanderung der Neuralleistenzellen und die Enwicklung der sensorischen und motorischen neuronalen Netzwerke wichtige Funktionen ausüben. Robo1 und Robo2 sind in Neuralleistenzellen, in Spinalganglien, in Motoneuronen und Interneuronen des Rückenmarks exprimiert. Robo3 ist nur in Interneuronen des Rückenmarks exprimiert. Slit1-3 werden von Zellen entlang der Migrationswege von Neuralleistenzellen und entlang der Bahnen der auswachsenden sensorischen und motorischen Axone exprimiert. Zudem sind sie in der Region der Bodenplatte (Slit1-3), entlang des Zentralkanales (Slit1 und 3), in der Region der Dachplatte (Slit 1-3), im ventralen Horn (Slit 1-3) und in der Nähe des Motor axon exit point (MEP, Slit1 und 3) exprimiert. Um die Funktionen der Robos und Slits in der Wanderung der Neuralleistenzellen und axonalen Wegfindung der sensorischen und Motoneuronen zu untersuchen, nutzten wir in ovo RNAi und Überexpressionsexperimente, gefolgt von Färbungen mit Neurofilament- und anderen Antikörpern an ganzen Embryonen und auf Quer- und Längsschnitten. Störung der Robo1, Robo2 und Slit1-3 Funktion mittels in ovo RNAi führte zu ektopischen Neuralleistenzellen im posterioren Teil der Somiten und im Dermamyotom und zur Aufhebung der metameren Segregation der Spinalganglien. Zentrale und periphere sensorische Fasern genauso wie die Axone von Motoneuronen machten Fehler in der Wegfindung in der Peripherie. Die Spinalganglien und Hinterwurzeln waren teilweise fusioniert und die peripheren Ausläufer defaszikuliert. Slit Überexpression führte zu verkleinerten Spinalganglien und zu starker Reduktion der Hinterwurzeln sowie der peripheren sensorischen und motorischen Nerven. In vitro Experimente, bei denen dissoziierte sensorische Neuronen oder ganze Spinalganglien auf einem Monolayer von Slit-exprimierenden COS-7 Zellen kultiviert wurden, zeigten, dass alle drei Slits das Neuritenwachstum stark hemmten. Zudem analysierten wir die Wegfindung von nozizeptiven (Schmerz-leitenden) und propriozeptiven (Reflexbogen) Kollateralen im Zentralnervensystem mit dem Tracer Fast DiI. Nozizeptive Kollateralen zeigten Wegfindungsfehler in Embryonen mit gestörter Robo1, Robo2, Slit1 und Slit3 Funktion. Die Zielfindung der propriozeptiven Kollateralen war in Embryos mit gestörter Slit3 Funktion fehlerhaft. Zusammenfassend zeigen meine Resultate neue Funktionen der Robos und Slits in der Migration der Neuralleistenzellen und in der Wegfindung der sensorischen und motorischen Axone in der Entwicklung des peripheren und zentralen Nervensystems im Hühnerembryo.

Abstract

Extracellular Slits and their transmembrane receptors, the Robos, represent a well characterized repulsive guidance system which is involved in different processes of axon guidance and migration of cells in invertebrates and vertebrates. In my dissertation, we dissected the role of Slits and Robos in axon guidance of sensory and motoneurons and their involvement in early neural crest cell migration. Robo1 and Robo2 are expressed in migrating neural crest cells, DRGs, motoneurons and interneurons of the spinal cord. Robo3 is only expressed in interneurons of the spinal cord. Slits are expressed along the migratory path of neural crest cells and the trajectories of sensory and motor axons. Downregulation of Robo1, Robo2 and members of the Slit family led to ectopic neural crest cells within the posterior part of the sclerotome and the dermomyotome and to perturbed formation of DRGs, dorsal roots and peripheral sensory branches as well as motoneurons. The metameric segregation was disturbed, DRGs and dorsal roots were elongated and fused and peripheral branches defasciculated. Overexpression of human and mouse Slits resulted in smaller DRGs and in the almost complete lack of dorsal roots and peripheral sensory branches as well as motoneurons. All three Slits strongly repelled DRG neurites in vitro and in vivo. Furthermore, we analysed the targeting of a subpopulation of nociceptive and proprioceptive sensory collaterals using Fast DiI as a tracer. Nociceptive collaterals showed pathfinding errors in embryos with impaired Robo1, Robo2, Slit1 and Slit3. Proprioceptive collaterals were severely affected only in Slit3 deficient embryos. Boundary cap cell clustering at the DREZ was affected in Robo1, Robo2 and Slit1-3 deficient embryos. The clusters were not properly segregated and aligned at the DREZ in the anterior and posterior somitic compartment. Thus, my results provide new insight in the function of Slit / Robo signalling in neural crest cell migration and in the development of the peripheral nervous system.

Slits, extrazellulär sezernierte Glykoproteine, und ihre Transmembranrezeptoren, die Robos (Roundabouts), spielen eine wichtige Rolle als Wegweisermoleküle während der Entwicklung des peripheren und zentralen Nervensystems in Wirbellosen und Wirbeltieren und sind meistens hoch konserviert zwischen den Spezies. Die Familie der Robos setzt sich aus vier Proteinen zusammen, genannt Robo1-4. Drei Slit Gene wurden identifiziert. Die genaue Analyse ihrer Expressionsmuster in Hühnerembryonen zwischen dem Hamburger / Hamilton Stadium 14 und Stadium 42 weist darauf hin, dass Slits und Robos für die Wanderung der Neuralleistenzellen und die Enwicklung der sensorischen und motorischen neuronalen Netzwerke wichtige Funktionen ausüben. Robo1 und Robo2 sind in Neuralleistenzellen, in Spinalganglien, in Motoneuronen und Interneuronen des Rückenmarks exprimiert. Robo3 ist nur in Interneuronen des Rückenmarks exprimiert. Slit1-3 werden von Zellen entlang der Migrationswege von Neuralleistenzellen und entlang der Bahnen der auswachsenden sensorischen und motorischen Axone exprimiert. Zudem sind sie in der Region der Bodenplatte (Slit1-3), entlang des Zentralkanales (Slit1 und 3), in der Region der Dachplatte (Slit 1-3), im ventralen Horn (Slit 1-3) und in der Nähe des Motor axon exit point (MEP, Slit1 und 3) exprimiert. Um die Funktionen der Robos und Slits in der Wanderung der Neuralleistenzellen und axonalen Wegfindung der sensorischen und Motoneuronen zu untersuchen, nutzten wir in ovo RNAi und Überexpressionsexperimente, gefolgt von Färbungen mit Neurofilament- und anderen Antikörpern an ganzen Embryonen und auf Quer- und Längsschnitten. Störung der Robo1, Robo2 und Slit1-3 Funktion mittels in ovo RNAi führte zu ektopischen Neuralleistenzellen im posterioren Teil der Somiten und im Dermamyotom und zur Aufhebung der metameren Segregation der Spinalganglien. Zentrale und periphere sensorische Fasern genauso wie die Axone von Motoneuronen machten Fehler in der Wegfindung in der Peripherie. Die Spinalganglien und Hinterwurzeln waren teilweise fusioniert und die peripheren Ausläufer defaszikuliert. Slit Überexpression führte zu verkleinerten Spinalganglien und zu starker Reduktion der Hinterwurzeln sowie der peripheren sensorischen und motorischen Nerven. In vitro Experimente, bei denen dissoziierte sensorische Neuronen oder ganze Spinalganglien auf einem Monolayer von Slit-exprimierenden COS-7 Zellen kultiviert wurden, zeigten, dass alle drei Slits das Neuritenwachstum stark hemmten. Zudem analysierten wir die Wegfindung von nozizeptiven (Schmerz-leitenden) und propriozeptiven (Reflexbogen) Kollateralen im Zentralnervensystem mit dem Tracer Fast DiI. Nozizeptive Kollateralen zeigten Wegfindungsfehler in Embryonen mit gestörter Robo1, Robo2, Slit1 und Slit3 Funktion. Die Zielfindung der propriozeptiven Kollateralen war in Embryos mit gestörter Slit3 Funktion fehlerhaft. Zusammenfassend zeigen meine Resultate neue Funktionen der Robos und Slits in der Migration der Neuralleistenzellen und in der Wegfindung der sensorischen und motorischen Axone in der Entwicklung des peripheren und zentralen Nervensystems im Hühnerembryo.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Stoeckli Esther, Neuhauss Stephan, Zimmermann Dieter
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:31 May 2019 07:49
Last Modified:15 Apr 2021 15:00
Number of Pages:113
OA Status:Green

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