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Selection and characterization of antibodies blocking the enzymatic activity of the tumour associated carbonic anhydrase IX


Murri-Plesko, Margarita Theresa. Selection and characterization of antibodies blocking the enzymatic activity of the tumour associated carbonic anhydrase IX. 2011, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Solide Tumoren sind oft schlecht durchblutet. Dadurch haben sie eine verringerte Zufuhr an Sauerstoff und Nährstoffen, wodurch ihr Wachstum limitiert wird. Sauerstoffmangel führt zu Änderungen in der Genexpression – hauptsächlich des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) – welche es den Krebszellen erlauben, sich an einen tiefen Sauerstoffgehalt anzupassen. Eines dieser Zielgene ist Carboanhydrase IX (CA IX), ein Transmembranprotein mit extrazellulärer Domäne, welche die reversible Hydratisierung von Kohlenstoffdioxid zu Hydrogencarbonat und Protonen katalysiert. CA IX wird hauptsächlich im Tumorgewebe exprimiert und nur sehr selten in gesundem Gewebe, wie z.B. dem gastrointestinalen Trakt. Die katalytische Aktivität erleichtert das Wachstum von Tumoren durch Senkung des extrazellulären pHs und Neutralisierung des intrazellulären pHs. Dadurch ist CA IX einerseits ein vielversprechender Marker für Tumortargeting und andererseits ein mögliches Ziel für eine die CA IX Aktivität inhibierende Tumortherapie. In der Klinik werden mehrere synthetische Stoffe eingesetzt, welche die CA IX Aktivität inhibieren. Da diese aber auch mit anderen Carboanhydrase Isoformen interagieren, haben sie häufig schwere Nebenwirkungen, und ihr Einsatz in der Klinik ist limitiert. Daneben verwendet man Antikörper, die CA IX sehr spezifisch binden. Diese sind sehr hilfreich im Visualisieren von Tumoren, leider ist ihre therapeutische Wirkung jedoch umstritten. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, CA IX spezifische Antikörper mit Enzym-inhibitorischer Aktion zu etablieren, um effizientere Therapien gegen solide Tumoren zu entwickeln.
In dieser Arbeit wurden mit Hilfe des Phagendisplays zwölf Fab-Antikörper (MSC 1 – 12) selektioniert, die spezifisch an rekombinantes humanes CA IX binden. Keine unspezifische Bindung an andere Isoformen mit sehr grosser Homologie, namentlich CA II, CA XII oder CA XIV, wurde beobachtet, was die selektive Bindung an CA IX bestätigt. Zusätzlich waren zwei Antikörper, MSC 1 und MSC 3, kreuzreaktiv mit murinem CA IX. MSC 3 IgG färbte murines CA IX spezifisch in Tumorschnitten und kann daher in einem syngenen Mausmodell eingesetzt werden.
Fünf Antikörper, MSC 2, MSC 5, MSC 8, MSC 10 und MSC 12, waren in der Lage, die enzymatische Funktion von CA IX in einem biochemischen Assay auf Membranfragmenten teilweise zu inhibieren. Der vielversprechendste der Antikörper, MSC 8, inhibierte die CA IX Aktivität um 57 % als Fab-Antikörper und um 76 % als bivalenter IgG. Zudem inhibierte MSC 8 Fab die CA IX Aktivität auf intakten Einzelzellen um 48 % bzw. MSC 8 IgG um 61 %. Daneben bewirkte MSC 8 IgG die Internalisierung von CA IX, wodurch die CA IX Aktivität auf der Zelloberfläche weiter reduziert werden dürfte.
Daher könnte der humane CA IX spezifische IgG MSC 8 einen weitaus grösseren Nutzen haben als zuvor entwickelte anti-CA IX Antikörper, indem Spezifität mit Inhibition der CA IX Enzym- Aktivität gekoppelt wird. Der therapeutische Effekt könnte weiter gesteigert werden, indem biologisch aktive Substanzen mit Hilfe dieser Antikörper spezifisch zu Zielzellen gebracht werden und durch Internalisierung direkt an ihren Wirkungsort gelangen. ABSTRACT The growth of solid tumours is limited by low supply of oxygen and nutrients due to poor vascularisation. Hypoxia leads to changes in gene expression mostly due to the hypoxia inducible factor (HIF), helping cancer cells to adapt to low oxygen levels. One of these target genes is carbonic anhydrase IX (CA IX), a transmembrane protein with an extracellular domain catalysing the reversible hydration of carbon dioxide to hydrogen carbonate and protons. CA IX expression is mostly limited to hypoxic tumour tissues. It is only rarely expressed in normal tissue, e.g. in the gastrointestinal tract. Its catalytic activity facilitates tumour growth by acidification of extracellular pH and neutralisation of intracellular pH. This makes carbonic anhydrase IX not only a promising marker for tumour targeting but also a potential target for tumour therapy by inhibiting CA IX enzymatic activity. Several chemical compounds inhibiting CA IX activity are used in the clinic. However, due to cross-reactivity with other carbonic anhydrase isoforms, they have severe side effects and their clinical use is very much limited. On the other hand, antibodies specifically targeting CA IX have proven to be very useful in tumour imaging, but their therapeutic effect is disputed. The aim of this thesis was therefore to establish CA IX specific antibodies blocking enzymatic activity in order to enhance efficacy of therapies against solid tumours.

In this thesis, twelve Fab antibodies, called MSC 1 – 12, specifically recognizing human CA IX were selected by phage display on recombinant human CA IX. No unspecific binding to any of the other highly homologous isoforms CA II, CA XII or CA XIV could be detected, confirming highly selective binding to CA IX. In addition, two of the antibodies, MSC 1 and MSC 3, were cross- reactive to murine CA IX. MSC 3 IgG specifically stained murine CA IX in tumour sections and can thus be used in syngeneic mouse models.
Five antibodies, MSC 2, MSC 5, MSC 8, MSC 10 and MSC 12, inhibited CA IX function partially in a biochemical assay on membrane fragments. The most potent of those antibodies, MSC 8, inhibited CA IX activity by up to 57 % as Fab antibody and 76 % as bivalent IgG. In addition, MSC 8 inhibited CA IX activity on intact single cells by 48 % and 61 % for MSC 8 Fab and MSC 8 IgG, respectively. In addition, MSC 8 IgG triggered CA IX internalisation which might further reduce CA IX activity on the cell surface.
Therefore, the fully human CA IX-specific IgG antibody MSC 8 may extend beyond the use of previously developed CA IX-antibodies by combining target-specificity with CA IX inhibitory activity. By delivering therapeutic moieties specifically to target cells and triggering internalisation of those compounds the here selected antibodies could further increase therapeutic efficacy.

Abstract

Solide Tumoren sind oft schlecht durchblutet. Dadurch haben sie eine verringerte Zufuhr an Sauerstoff und Nährstoffen, wodurch ihr Wachstum limitiert wird. Sauerstoffmangel führt zu Änderungen in der Genexpression – hauptsächlich des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) – welche es den Krebszellen erlauben, sich an einen tiefen Sauerstoffgehalt anzupassen. Eines dieser Zielgene ist Carboanhydrase IX (CA IX), ein Transmembranprotein mit extrazellulärer Domäne, welche die reversible Hydratisierung von Kohlenstoffdioxid zu Hydrogencarbonat und Protonen katalysiert. CA IX wird hauptsächlich im Tumorgewebe exprimiert und nur sehr selten in gesundem Gewebe, wie z.B. dem gastrointestinalen Trakt. Die katalytische Aktivität erleichtert das Wachstum von Tumoren durch Senkung des extrazellulären pHs und Neutralisierung des intrazellulären pHs. Dadurch ist CA IX einerseits ein vielversprechender Marker für Tumortargeting und andererseits ein mögliches Ziel für eine die CA IX Aktivität inhibierende Tumortherapie. In der Klinik werden mehrere synthetische Stoffe eingesetzt, welche die CA IX Aktivität inhibieren. Da diese aber auch mit anderen Carboanhydrase Isoformen interagieren, haben sie häufig schwere Nebenwirkungen, und ihr Einsatz in der Klinik ist limitiert. Daneben verwendet man Antikörper, die CA IX sehr spezifisch binden. Diese sind sehr hilfreich im Visualisieren von Tumoren, leider ist ihre therapeutische Wirkung jedoch umstritten. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, CA IX spezifische Antikörper mit Enzym-inhibitorischer Aktion zu etablieren, um effizientere Therapien gegen solide Tumoren zu entwickeln.
In dieser Arbeit wurden mit Hilfe des Phagendisplays zwölf Fab-Antikörper (MSC 1 – 12) selektioniert, die spezifisch an rekombinantes humanes CA IX binden. Keine unspezifische Bindung an andere Isoformen mit sehr grosser Homologie, namentlich CA II, CA XII oder CA XIV, wurde beobachtet, was die selektive Bindung an CA IX bestätigt. Zusätzlich waren zwei Antikörper, MSC 1 und MSC 3, kreuzreaktiv mit murinem CA IX. MSC 3 IgG färbte murines CA IX spezifisch in Tumorschnitten und kann daher in einem syngenen Mausmodell eingesetzt werden.
Fünf Antikörper, MSC 2, MSC 5, MSC 8, MSC 10 und MSC 12, waren in der Lage, die enzymatische Funktion von CA IX in einem biochemischen Assay auf Membranfragmenten teilweise zu inhibieren. Der vielversprechendste der Antikörper, MSC 8, inhibierte die CA IX Aktivität um 57 % als Fab-Antikörper und um 76 % als bivalenter IgG. Zudem inhibierte MSC 8 Fab die CA IX Aktivität auf intakten Einzelzellen um 48 % bzw. MSC 8 IgG um 61 %. Daneben bewirkte MSC 8 IgG die Internalisierung von CA IX, wodurch die CA IX Aktivität auf der Zelloberfläche weiter reduziert werden dürfte.
Daher könnte der humane CA IX spezifische IgG MSC 8 einen weitaus grösseren Nutzen haben als zuvor entwickelte anti-CA IX Antikörper, indem Spezifität mit Inhibition der CA IX Enzym- Aktivität gekoppelt wird. Der therapeutische Effekt könnte weiter gesteigert werden, indem biologisch aktive Substanzen mit Hilfe dieser Antikörper spezifisch zu Zielzellen gebracht werden und durch Internalisierung direkt an ihren Wirkungsort gelangen. ABSTRACT The growth of solid tumours is limited by low supply of oxygen and nutrients due to poor vascularisation. Hypoxia leads to changes in gene expression mostly due to the hypoxia inducible factor (HIF), helping cancer cells to adapt to low oxygen levels. One of these target genes is carbonic anhydrase IX (CA IX), a transmembrane protein with an extracellular domain catalysing the reversible hydration of carbon dioxide to hydrogen carbonate and protons. CA IX expression is mostly limited to hypoxic tumour tissues. It is only rarely expressed in normal tissue, e.g. in the gastrointestinal tract. Its catalytic activity facilitates tumour growth by acidification of extracellular pH and neutralisation of intracellular pH. This makes carbonic anhydrase IX not only a promising marker for tumour targeting but also a potential target for tumour therapy by inhibiting CA IX enzymatic activity. Several chemical compounds inhibiting CA IX activity are used in the clinic. However, due to cross-reactivity with other carbonic anhydrase isoforms, they have severe side effects and their clinical use is very much limited. On the other hand, antibodies specifically targeting CA IX have proven to be very useful in tumour imaging, but their therapeutic effect is disputed. The aim of this thesis was therefore to establish CA IX specific antibodies blocking enzymatic activity in order to enhance efficacy of therapies against solid tumours.

In this thesis, twelve Fab antibodies, called MSC 1 – 12, specifically recognizing human CA IX were selected by phage display on recombinant human CA IX. No unspecific binding to any of the other highly homologous isoforms CA II, CA XII or CA XIV could be detected, confirming highly selective binding to CA IX. In addition, two of the antibodies, MSC 1 and MSC 3, were cross- reactive to murine CA IX. MSC 3 IgG specifically stained murine CA IX in tumour sections and can thus be used in syngeneic mouse models.
Five antibodies, MSC 2, MSC 5, MSC 8, MSC 10 and MSC 12, inhibited CA IX function partially in a biochemical assay on membrane fragments. The most potent of those antibodies, MSC 8, inhibited CA IX activity by up to 57 % as Fab antibody and 76 % as bivalent IgG. In addition, MSC 8 inhibited CA IX activity on intact single cells by 48 % and 61 % for MSC 8 Fab and MSC 8 IgG, respectively. In addition, MSC 8 IgG triggered CA IX internalisation which might further reduce CA IX activity on the cell surface.
Therefore, the fully human CA IX-specific IgG antibody MSC 8 may extend beyond the use of previously developed CA IX-antibodies by combining target-specificity with CA IX inhibitory activity. By delivering therapeutic moieties specifically to target cells and triggering internalisation of those compounds the here selected antibodies could further increase therapeutic efficacy.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Renner Christoph, Wenger Roland, Moch Holger
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2011
Deposited On:24 May 2019 07:49
Last Modified:25 Sep 2019 00:13
Number of Pages:105
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod006630806&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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