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Gene therapy for chronic granulomatous disease and anti-Aspergillus activity of reconstituted neutrophil extracellular trap formation


Bianchi, Matteo. Gene therapy for chronic granulomatous disease and anti-Aspergillus activity of reconstituted neutrophil extracellular trap formation. 2011, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Die septische Granulomatose (engl. chronic granulomatous disease, CGD) ist eine Gruppe von primären Immundefekten, die durch Mutationen in für die Phagozyten Nikotinamid Adenin Dinucleotid Phosphat (NADPH) Oxidase kodierenden Genen (gp91phox, p22phox, p47phox, p67phox, and p40phox) bedingt ist. CGD Phagozyten produzieren keine reaktiven Sauerstoffverbindungen (engl. reactive oxygen species, ROS), töten Mikroben schlecht ab und betroffene Patienten leiden daher an rezidivierenden lebensbedrohlichen Infektionen mit Bakterien und Schimmelpilzen. Aspergillus spp. Infektionen, die Pneumonien und disseminierte Infektionen hervorrufen können, sind die Haupttodesursache von CGD Patienten. Bisher war es unklar, wie gesunde Neutrophile Granulozyten Aspergillus Spezies kontrollieren. Wir haben daher die Rolle von NADPH Oxidase abhängigen extrazellulären Neutrophilen Fallen (eng. Neutrophil Extracellular Traps, NETs) in Hinsicht auf die anti- Aspergillus Abwehr bei Patienten mit CGD untersucht. NETs werden nach Aktivierung von Neutrophilen freigesetzt und bestehen aus Chromatin (DNA und Histone), das mit granulären und zytoplasmatischen antimikrobiellen Proteinen besetzt ist. NETs binden und halten Bakterien und Pilze gefangen und setzen sie antimikrobiellen Proteinen aus. Die Bildung von NETs benötigt zwingend ROS, die von der NADPH Oxidase produziert werden. Daher können CGD Neutrophile keine NETs bilden. Wir haben erstmals gezeigt, dass mikrobizide NETs gegen A. nidulans Konidien und Hyphen in vitro wirksam sind, und dass die Rekonstitution der NADPH Oxidase Aktivität durch Gentherapie (GT) bei einem Patienten mit X-chromosomal vererbter CGD die NETs Bildung wiederhergestellt hat. Dies hat zur Ausheilung einer schweren invasiven A. nidulans Infektion in vivo beigetragen. Wir haben ferner die kritische Rolle von NET-Assoziiertem Calprotectin demonstriert, das mittels Zink- Sequestrierung Dosis-abhängig eine fungistatische oder fungizide anti-Aspergillus Wirkung hat. GT für CGD soll den Defekt der NADPH Oxidase Untereinheiten durch die Insertion einer normalen Kopie des verantwortlichen defekten Gens in autologe hämatopoetischen Stammzellen des jeweiligen Patienten funktionell korrigieren und die Krankheit dauerhaft heilen. In internationaler Kollaboration wurden kürzlich in unserer Abteilung für Immunologie/Hämatologie/KMT am Universitätskinderspital Zürich γ-retrovirale GT Vektoren in klinischen Phase I/II Studien kürzlich ausführlich getestet und die klinische Wirksamkeit der GT für X-chromosomale CGD (gp91phox Defekt) gezeigt. Allerdings machen unerwartete Nebenwirkungen wie Ausschalten (Silencing) der Transgenaktivität und Transaktivierung von Onkogenen eine Verbesserung der Vektoren-Effizienz und -Sicherheit vor künftigen klinischen GT Studien an CGD Patienten zwingend nötig.

Chronic granulomatous disease (CGD) is a group of primary immunodeficiencies caused by mutations in genes encoding phagocyte nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase subunits (gp91phox, p22phox, p47phox, p67phox, and p40phox). CGD phagocytes do not produce reactive oxygen species (ROS), kill microbes poorly and consequently patients are susceptible to recurrent life-threatening bacterial and fungal infections. Aspergillus spp. infections, which cause pneumonia and disseminated disease, are the leading cause of death in CGD patients. Up to now it was unclear how neutrophils control Aspergillus species in healthy individuals. We therefore set out to study the role of NADPH oxidase dependent neutrophil extracellular traps (NETs) in anti-Aspergillus defense in CGD. NETs are released after neutrophil activation and are composed of chromatin (DNA and histones) decorated with granular and cytoplasmic proteins. NETs bind and trap bacteria and fungi and expose antimicrobial molecules. Generation of NETs requires ROS produced by the NADPH oxidase; therefore CGD neutrophils cannot release NETs. We showed for the first time that the microbicidal pathway through NETs is efficient against A. nidulans conidia and hyphae in vitro, and that restoration of NET formation was achieved by complementation of NADPH oxidase function by gene therapy (GT) in a patient with X-linked CGD. This aided clearing severe invasive A. nidulans infection in vivo. We demonstrated the critical role of NET- associate calprotectin for dose-dependent fungistatic of fungicidal anti-Aspergillus activity by Zn2+ sequestration. Gene therapy (GT) for CGD aims at functional correction of the NADPH oxidase subunit defects by insertion of a normal copy of the responsible gene into autologous patient derived hematopoietic stem cells (HSC) to cure the disease. γ-retroviral GT vectors have been extensively studied in international collaboration in recent phase I/II clinical GT for X- linked (gp91phox-deficient) CGD in our Division of Immunology/Haematology/BMT at University Children’s Hospital Zurich, proving feasibility of this approach. However, unexpected side effects like transgene silencing and oncogene transactivation impose improvements in vector efficacy and safety for future clinical GT trials. We therefore developed and functionally studied next generation γ-retroviral self- inactivating (SIN) vectors as candidates for future clinical X-CGD GT trials. Among the myelospecific vectors tested in vitro, we identified the human MRP8 and miRNA-223 promoters as most efficient in driving gp91phox expression, leading to ROS production and NET formation in differentiated human X-CGD hematopoietic stem cells.

Abstract

Die septische Granulomatose (engl. chronic granulomatous disease, CGD) ist eine Gruppe von primären Immundefekten, die durch Mutationen in für die Phagozyten Nikotinamid Adenin Dinucleotid Phosphat (NADPH) Oxidase kodierenden Genen (gp91phox, p22phox, p47phox, p67phox, and p40phox) bedingt ist. CGD Phagozyten produzieren keine reaktiven Sauerstoffverbindungen (engl. reactive oxygen species, ROS), töten Mikroben schlecht ab und betroffene Patienten leiden daher an rezidivierenden lebensbedrohlichen Infektionen mit Bakterien und Schimmelpilzen. Aspergillus spp. Infektionen, die Pneumonien und disseminierte Infektionen hervorrufen können, sind die Haupttodesursache von CGD Patienten. Bisher war es unklar, wie gesunde Neutrophile Granulozyten Aspergillus Spezies kontrollieren. Wir haben daher die Rolle von NADPH Oxidase abhängigen extrazellulären Neutrophilen Fallen (eng. Neutrophil Extracellular Traps, NETs) in Hinsicht auf die anti- Aspergillus Abwehr bei Patienten mit CGD untersucht. NETs werden nach Aktivierung von Neutrophilen freigesetzt und bestehen aus Chromatin (DNA und Histone), das mit granulären und zytoplasmatischen antimikrobiellen Proteinen besetzt ist. NETs binden und halten Bakterien und Pilze gefangen und setzen sie antimikrobiellen Proteinen aus. Die Bildung von NETs benötigt zwingend ROS, die von der NADPH Oxidase produziert werden. Daher können CGD Neutrophile keine NETs bilden. Wir haben erstmals gezeigt, dass mikrobizide NETs gegen A. nidulans Konidien und Hyphen in vitro wirksam sind, und dass die Rekonstitution der NADPH Oxidase Aktivität durch Gentherapie (GT) bei einem Patienten mit X-chromosomal vererbter CGD die NETs Bildung wiederhergestellt hat. Dies hat zur Ausheilung einer schweren invasiven A. nidulans Infektion in vivo beigetragen. Wir haben ferner die kritische Rolle von NET-Assoziiertem Calprotectin demonstriert, das mittels Zink- Sequestrierung Dosis-abhängig eine fungistatische oder fungizide anti-Aspergillus Wirkung hat. GT für CGD soll den Defekt der NADPH Oxidase Untereinheiten durch die Insertion einer normalen Kopie des verantwortlichen defekten Gens in autologe hämatopoetischen Stammzellen des jeweiligen Patienten funktionell korrigieren und die Krankheit dauerhaft heilen. In internationaler Kollaboration wurden kürzlich in unserer Abteilung für Immunologie/Hämatologie/KMT am Universitätskinderspital Zürich γ-retrovirale GT Vektoren in klinischen Phase I/II Studien kürzlich ausführlich getestet und die klinische Wirksamkeit der GT für X-chromosomale CGD (gp91phox Defekt) gezeigt. Allerdings machen unerwartete Nebenwirkungen wie Ausschalten (Silencing) der Transgenaktivität und Transaktivierung von Onkogenen eine Verbesserung der Vektoren-Effizienz und -Sicherheit vor künftigen klinischen GT Studien an CGD Patienten zwingend nötig.

Chronic granulomatous disease (CGD) is a group of primary immunodeficiencies caused by mutations in genes encoding phagocyte nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase subunits (gp91phox, p22phox, p47phox, p67phox, and p40phox). CGD phagocytes do not produce reactive oxygen species (ROS), kill microbes poorly and consequently patients are susceptible to recurrent life-threatening bacterial and fungal infections. Aspergillus spp. infections, which cause pneumonia and disseminated disease, are the leading cause of death in CGD patients. Up to now it was unclear how neutrophils control Aspergillus species in healthy individuals. We therefore set out to study the role of NADPH oxidase dependent neutrophil extracellular traps (NETs) in anti-Aspergillus defense in CGD. NETs are released after neutrophil activation and are composed of chromatin (DNA and histones) decorated with granular and cytoplasmic proteins. NETs bind and trap bacteria and fungi and expose antimicrobial molecules. Generation of NETs requires ROS produced by the NADPH oxidase; therefore CGD neutrophils cannot release NETs. We showed for the first time that the microbicidal pathway through NETs is efficient against A. nidulans conidia and hyphae in vitro, and that restoration of NET formation was achieved by complementation of NADPH oxidase function by gene therapy (GT) in a patient with X-linked CGD. This aided clearing severe invasive A. nidulans infection in vivo. We demonstrated the critical role of NET- associate calprotectin for dose-dependent fungistatic of fungicidal anti-Aspergillus activity by Zn2+ sequestration. Gene therapy (GT) for CGD aims at functional correction of the NADPH oxidase subunit defects by insertion of a normal copy of the responsible gene into autologous patient derived hematopoietic stem cells (HSC) to cure the disease. γ-retroviral GT vectors have been extensively studied in international collaboration in recent phase I/II clinical GT for X- linked (gp91phox-deficient) CGD in our Division of Immunology/Haematology/BMT at University Children’s Hospital Zurich, proving feasibility of this approach. However, unexpected side effects like transgene silencing and oncogene transactivation impose improvements in vector efficacy and safety for future clinical GT trials. We therefore developed and functionally studied next generation γ-retroviral self- inactivating (SIN) vectors as candidates for future clinical X-CGD GT trials. Among the myelospecific vectors tested in vitro, we identified the human MRP8 and miRNA-223 promoters as most efficient in driving gp91phox expression, leading to ROS production and NET formation in differentiated human X-CGD hematopoietic stem cells.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Fraefel Cornel, Trkola Alexandra
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2011
Deposited On:24 May 2019 14:00
Last Modified:25 Sep 2019 00:13
Number of Pages:138
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod006958617&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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