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Epigenetic deregulation in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts


Karouzakis, Emmanuel. Epigenetic deregulation in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. 2011, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Die Rheumatoid Arthritis (RA) ist eine chronische Autoimmunerkrankung mit fortschreitender Zerstörung der Gelenke. In der Pathogenese der Erkrankung spielen zwei zelluläre Kompartimente eine wesentliche Rolle. Das eine beinhaltet aktivierte Immunzellen wie T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen. Kennzeichnend für diese Gruppe ist das Freisetzen von entzündlichen Botenstoffen (Zytokine) wie Interleukin (IL)- 1 beta, IL-6 und „tumor-necrosis-factor“ (TNF) alpha sowie Autoantikörpern von Plasmazellen. Das andere umfasst die aktivierten synovialen Fibroblasten (RASF), Osteoklasten und Chondrozyten, alles Effektorzellen, die durch Aktivierung zur Zerstörung der Gelenke beitragen.

Bis heute konnte kein genetischer Polymorphismus aufgezeigt werden, der den aktivierten Phänotyp dieser synovialer Fibroblasten ausreichend erklärt. Unsere Hypothese ist, dass epigenetische Modifikationen, insbesondere veränderte DNA Methylierung zur Aktivierung dieser Zellen beitragen und so die Zerstörung von Knorpel- und Knochensubstanz herbeiführen.

Wir zeigen hier erstmalig eine Untersuchung des Methylierungsmusters synovialer Fibroblasten von Patienten mit RA. In in vivo Untersuchungen wiesen synoviale Gewebe von Patienten mit RA eine signifikante Hypomethylierung in den untersuchten Zellkernen auf im Vergleich zu Geweben von Patienten mit Osteoarthritis (OA). Und das betrifft insbesondere die synovialen Fibroblasten wie bei in vitro Untersuchungen isolierter Zellkerne gezeigt werden konnte (Chapter 2, Figure 1).

Inflammatorische Zytokine wie TNF alpha und IL-1 beta hatten einen positiven Einfluss auf den Zellzyklus und gleichzeitig führten sie zu einer reduzierter Menge an 5-Methylcytosin in den Zellkernen der untersuchten Zellen. Wir zeigen hier eine reduzierte Expression von DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) in RASF, die möglicherweise zur progressiven Hypomethylierung dieser Zellen beiträgt. In diesem Zusammenhang unterstützen proinflammatorische Zytokine den Prozess der DNA Hypomethylierung durch Aktivierung der Zellproliferation, sie sind aber nicht die Ursache des niedrigen basalen Levels an DNMT1 in RASF. Darüber hinaus konnten wir aufzeigen, dass repetitive Sequenzen wie LINE-1 in RASF demethyliert sind, was die Hypothese einer globalen Hypomethylierung in RASF unterstützt.

Um die für den aktivierten Phänotyp synovialer RA Fibroblasten verantwortlichen Gene zu identifizieren, wurden synoviele Fibroblasten von gesunden Probanden über einen Zeitraum von 2 Monaten mit nicht toxischen Mengen des DNMT1-Inhibitors 5-azacytidine (5-azaC) behandelt, und anschießend eine Genexpressionsanalyse durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass mehr als die Hälfte der so überexprimierten Gene mit denen übereinstimmen, die mit der Pathogenese der RA assoziiert wurden. Dies sind Gene, die zur Gelenkzerstörung beitragen wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Integrine und viele weitere, die im Kapitel 2 aufgeführt sind (Suppl. Tables 1,2).

In Kapitel 3 zeigen wir die Untersuchung eines spezifischen Gens mit verändertem Methylierungsmuster in RASF. Aktivierte RASF exprimieren unterschiedliche Chemokine, die so weitere Immunzellen in die betroffenen Gelenke locken. CXCL12 (SDF-1α) ist eines dieser Chemokine, welches in RASF überexprimiert wird. Wir konnten nachweisen, dass im Vergleich zu OASF, in RASF der Promotor von CXCL12 weniger methyliert ist. Weiterhin korrelierte die Expression von CXCL12 auf mRNA Level in diesen Zellen signifikant mit der Hypomethylierung im CXCL12 Promotor. Die durch Hypomethylierung verstärkte Expression von CXCL12 in RASF induzierte dann in den Zellen eine verstärkte Expression von MMPs durch die Bindung an den dazugehörigen Rezeptor CXCR7.

Wir beschreiben hier einen endogenen Aktivierungsmechanismus in RASF, der zur progressiven Zerstörung der Gelenke beiträgt. Basierend auf unserer Daten verursacht eine veränderte globale und genspezifische DNA Methylierung den aktivierten invasiven Phänotyp der RASF. Summary

Rheumatoid arthritis is a chronic autoimmune disease involving destruction of affected joints. Two cellular compartments are involved in the pathogenesis of RA. The first one involves activated T cells, B cells and macrophages. They secrete a variety of pro-inflammatory cytokines such as interleukin- 1beta, IL-6 and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) as well as a variety of autoantibodies. The second compartment involves activated rheumatoid arthritis synovial fibroblasts (RASF), osteoclasts and chondrocytes that are the effector cells of joint destruction. The thesis focuses on the epigenetic mechanisms leading to the activated phenotype of RASF.

Since to date no genetic polymorphism can explain the hyperactive phenotype of synovial fibroblasts, we hypothesised that epigenetic modifications, particularly impaired DNA methylation, can cause the activation of synovial fibroblasts and lead to joint destruction. For the first time, the methylation status of cells was analysed in the synovium of patients with rheumatoid arthritis (RA). RA synovial tissues were found to have hypomethylated nuclei (Chapter 2, Figure 1). Especially RASF had low amounts of 5-methylcytosine. Pro-inflammatory cytokines such as TNF alpha and IL-1 beta induced cell cycle progression and reduced further the amount of 5-methylcytosine in the nuclei. We reported a deficiency of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) in RASF that can be an important factor involved in the progressive demethylation. In this context, pro-inflammatory cytokines favor DNA hypomethylation by increasing the rate of cell proliferation; however, they were not responsible for low basal levels of DNMT1. Furthermore, repetitive sequences such as LINE-1 were demethylated in RASF, supporting the hypothesis of an active global hypomethylation in these cells. To mimic the chronic hypomethylation state of synovial fibroblasts and identify gene targets, normal synovial fibroblasts were treated over a long period of time (2 months) with a non-toxic dose of the DNMT1 inhibitor 5- azacytidine (5-azaC) and a gene expression analysis was performed. More than half of the genes that were found to be overexpressed by this treatment were previously associated with the pathogenesis of RA. These included genes associated with joint destruction such as matrix metalloproteinases (MMPs), integrins and others summarized in Chapter 2 (Suppl. Tables 1,2).

Finally, a specific gene target that may have an impaired DNA methylation in RASF was analysed in Chapter 3. Activated RASF secrete chemokines that attract a variety of inflammatory cells into the joint. CXCL12 (SDF-1α) is a chemokine overexpressed and secreted by RASF. We reported that the promoter of CXCL12 is less methylated in RASF than in osteoarthritis synovial fibroblasts (OASF). The mRNA expression of CXCL12 significantly correlated with the CXCL12 promoter methylation. The upregulation of CXCL12 could stimulate RASF to produce more MMPs via the receptor CXCR7.

Thereby, we describe an endogenously activated pathway in RASF which promotes joint destruction. In conclusion, this study confirms the hypothesis that global and gene specific DNA methylation alterations are responsible for the activated phenotype of RASF.

Abstract

Die Rheumatoid Arthritis (RA) ist eine chronische Autoimmunerkrankung mit fortschreitender Zerstörung der Gelenke. In der Pathogenese der Erkrankung spielen zwei zelluläre Kompartimente eine wesentliche Rolle. Das eine beinhaltet aktivierte Immunzellen wie T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen. Kennzeichnend für diese Gruppe ist das Freisetzen von entzündlichen Botenstoffen (Zytokine) wie Interleukin (IL)- 1 beta, IL-6 und „tumor-necrosis-factor“ (TNF) alpha sowie Autoantikörpern von Plasmazellen. Das andere umfasst die aktivierten synovialen Fibroblasten (RASF), Osteoklasten und Chondrozyten, alles Effektorzellen, die durch Aktivierung zur Zerstörung der Gelenke beitragen.

Bis heute konnte kein genetischer Polymorphismus aufgezeigt werden, der den aktivierten Phänotyp dieser synovialer Fibroblasten ausreichend erklärt. Unsere Hypothese ist, dass epigenetische Modifikationen, insbesondere veränderte DNA Methylierung zur Aktivierung dieser Zellen beitragen und so die Zerstörung von Knorpel- und Knochensubstanz herbeiführen.

Wir zeigen hier erstmalig eine Untersuchung des Methylierungsmusters synovialer Fibroblasten von Patienten mit RA. In in vivo Untersuchungen wiesen synoviale Gewebe von Patienten mit RA eine signifikante Hypomethylierung in den untersuchten Zellkernen auf im Vergleich zu Geweben von Patienten mit Osteoarthritis (OA). Und das betrifft insbesondere die synovialen Fibroblasten wie bei in vitro Untersuchungen isolierter Zellkerne gezeigt werden konnte (Chapter 2, Figure 1).

Inflammatorische Zytokine wie TNF alpha und IL-1 beta hatten einen positiven Einfluss auf den Zellzyklus und gleichzeitig führten sie zu einer reduzierter Menge an 5-Methylcytosin in den Zellkernen der untersuchten Zellen. Wir zeigen hier eine reduzierte Expression von DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1) in RASF, die möglicherweise zur progressiven Hypomethylierung dieser Zellen beiträgt. In diesem Zusammenhang unterstützen proinflammatorische Zytokine den Prozess der DNA Hypomethylierung durch Aktivierung der Zellproliferation, sie sind aber nicht die Ursache des niedrigen basalen Levels an DNMT1 in RASF. Darüber hinaus konnten wir aufzeigen, dass repetitive Sequenzen wie LINE-1 in RASF demethyliert sind, was die Hypothese einer globalen Hypomethylierung in RASF unterstützt.

Um die für den aktivierten Phänotyp synovialer RA Fibroblasten verantwortlichen Gene zu identifizieren, wurden synoviele Fibroblasten von gesunden Probanden über einen Zeitraum von 2 Monaten mit nicht toxischen Mengen des DNMT1-Inhibitors 5-azacytidine (5-azaC) behandelt, und anschießend eine Genexpressionsanalyse durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass mehr als die Hälfte der so überexprimierten Gene mit denen übereinstimmen, die mit der Pathogenese der RA assoziiert wurden. Dies sind Gene, die zur Gelenkzerstörung beitragen wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Integrine und viele weitere, die im Kapitel 2 aufgeführt sind (Suppl. Tables 1,2).

In Kapitel 3 zeigen wir die Untersuchung eines spezifischen Gens mit verändertem Methylierungsmuster in RASF. Aktivierte RASF exprimieren unterschiedliche Chemokine, die so weitere Immunzellen in die betroffenen Gelenke locken. CXCL12 (SDF-1α) ist eines dieser Chemokine, welches in RASF überexprimiert wird. Wir konnten nachweisen, dass im Vergleich zu OASF, in RASF der Promotor von CXCL12 weniger methyliert ist. Weiterhin korrelierte die Expression von CXCL12 auf mRNA Level in diesen Zellen signifikant mit der Hypomethylierung im CXCL12 Promotor. Die durch Hypomethylierung verstärkte Expression von CXCL12 in RASF induzierte dann in den Zellen eine verstärkte Expression von MMPs durch die Bindung an den dazugehörigen Rezeptor CXCR7.

Wir beschreiben hier einen endogenen Aktivierungsmechanismus in RASF, der zur progressiven Zerstörung der Gelenke beiträgt. Basierend auf unserer Daten verursacht eine veränderte globale und genspezifische DNA Methylierung den aktivierten invasiven Phänotyp der RASF. Summary

Rheumatoid arthritis is a chronic autoimmune disease involving destruction of affected joints. Two cellular compartments are involved in the pathogenesis of RA. The first one involves activated T cells, B cells and macrophages. They secrete a variety of pro-inflammatory cytokines such as interleukin- 1beta, IL-6 and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) as well as a variety of autoantibodies. The second compartment involves activated rheumatoid arthritis synovial fibroblasts (RASF), osteoclasts and chondrocytes that are the effector cells of joint destruction. The thesis focuses on the epigenetic mechanisms leading to the activated phenotype of RASF.

Since to date no genetic polymorphism can explain the hyperactive phenotype of synovial fibroblasts, we hypothesised that epigenetic modifications, particularly impaired DNA methylation, can cause the activation of synovial fibroblasts and lead to joint destruction. For the first time, the methylation status of cells was analysed in the synovium of patients with rheumatoid arthritis (RA). RA synovial tissues were found to have hypomethylated nuclei (Chapter 2, Figure 1). Especially RASF had low amounts of 5-methylcytosine. Pro-inflammatory cytokines such as TNF alpha and IL-1 beta induced cell cycle progression and reduced further the amount of 5-methylcytosine in the nuclei. We reported a deficiency of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) in RASF that can be an important factor involved in the progressive demethylation. In this context, pro-inflammatory cytokines favor DNA hypomethylation by increasing the rate of cell proliferation; however, they were not responsible for low basal levels of DNMT1. Furthermore, repetitive sequences such as LINE-1 were demethylated in RASF, supporting the hypothesis of an active global hypomethylation in these cells. To mimic the chronic hypomethylation state of synovial fibroblasts and identify gene targets, normal synovial fibroblasts were treated over a long period of time (2 months) with a non-toxic dose of the DNMT1 inhibitor 5- azacytidine (5-azaC) and a gene expression analysis was performed. More than half of the genes that were found to be overexpressed by this treatment were previously associated with the pathogenesis of RA. These included genes associated with joint destruction such as matrix metalloproteinases (MMPs), integrins and others summarized in Chapter 2 (Suppl. Tables 1,2).

Finally, a specific gene target that may have an impaired DNA methylation in RASF was analysed in Chapter 3. Activated RASF secrete chemokines that attract a variety of inflammatory cells into the joint. CXCL12 (SDF-1α) is a chemokine overexpressed and secreted by RASF. We reported that the promoter of CXCL12 is less methylated in RASF than in osteoarthritis synovial fibroblasts (OASF). The mRNA expression of CXCL12 significantly correlated with the CXCL12 promoter methylation. The upregulation of CXCL12 could stimulate RASF to produce more MMPs via the receptor CXCR7.

Thereby, we describe an endogenously activated pathway in RASF which promotes joint destruction. In conclusion, this study confirms the hypothesis that global and gene specific DNA methylation alterations are responsible for the activated phenotype of RASF.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Gassmann Max, Gay Steffen, Fontana Adriano, Jiricny Josef
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2011
Deposited On:24 May 2019 15:41
Last Modified:25 Sep 2019 00:13
Number of Pages:106
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod007275320&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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