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Structural and functional investigations of plant metallothioneins


Huber, Tamara. Structural and functional investigations of plant metallothioneins. 2013, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary Metallothioneins (MTs) are small cysteine-rich proteins coordinating various transition metal ions preferably with the electron configuration d10. They are ubiquitously present in most phyla, and next to phytochelatins they represent a successful molecular concept for metal complexation in cells. Although MTs have been studied for decades still limited information is available. Especially plant MTs are not examined sufficiently, neither in structural nor in functional aspects. This study deals mainly with elucidating the structural and functional characteristics of the plant MT2 (cicMT2) from chickpea (Cicer arietinum). As a typical member of the plant MT subgroup p2, it has an N- and C-terminal metal binding region with a long cysteine-devoid linker region in between. The binding of five divalent metal ions (mainly Zn2+ and Cd2+ ions) to the 14 thiolate groups of the cysteines leads to a single metal-thiolate cluster. Recent studies showed the incorporation of sulfide ions into the metal-thiolate cluster of cicMT2. Although the presence of sulfide ions in plant and other MTs has already been reported previously, many details remained unclear. The further in vitro characterization with various analytical techniques could enlighten the features of the cluster in terms of mono- and divalent metal ions, stability, sulfide-modulated increase in cluster size, the influence of the environment on the various isoforms, and the mechanism of the incorporation itself. From our findings we can conclude that sulfide ion incorporation is highly influenced by the metal ion and sulfide ion availability in the experimental setup. While a clear incorporation of sulfide ions can be shown with divalent metal ions, also a change in cluster structure can be reported for monovalent metal ions but its specific features are still under discussion. The size of the cadmium-sulfide-thiolate cluster shows a dependence on the initial available free sulfide ion concentration. In case of cicMT2, the cluster can be enlarged to a multiple size of the one without sulfide ions. Evaluation of the mechanism of sulfide containing Cd2+-thiolate cluster formation reveals a slight distortion or opening of the preformed cluster structure by sulfide ions prior to insertion of additional metal ions into the cluster. To probe the general ability of metallothioneins to form sulfide containing metal-thiolate clusters, analogous experiments were performed with a mammalian MT revealing a probable role of the long cysteine- free linker region present in most plant MTs. Further, determination of the overall 3D structure of cicMT2 was attempted by nuclear magnetic resonance spectroscopy. The obtained spectra indicate intrinsically disordered structures, which might however even be favorable for the metal related function of the protein. Next to the structural features of cicMT2, the function of a variety of plant MTs was approached with yeast complementation assays. These experiments will require further efforts. All in all, we elaborated different aspects of plant metallothioneins, yet a lot of facets are hidden in the dark. Zusammenfassung Metallothionine (MTs) sind kleine cystein-reiche Proteine, die bevorzugt Übergangsmetalle mit einer d10 Elektronenkonfiguration binden. Sie kommen in einem grossen Teil der bekannten Lebensformen vor und repräsentieren neben den Phytochelatinen ein erfolgreiches molekulares Konzept für die Metallkomplexierung in Zellen. Obwohl MTs seit Jahrzehnten studiert werden, sind die vorhandenen Informationen immer noch beschränkt. Insbesondere die pflanzlichen MTs sind wenig untersucht, weder in struktureller noch funktioneller Hinsicht. Diese Studie behandelt hauptsächlich strukturelle und funktionelle Aspekte des pflanzlichen MT2 (cicMT2) der Kichererbse (Cicer arietinum). Als typisches Mitglied der pflanzlichen MT-Untergruppe p2 hat cicMT2 eine N- und C-terminale Metallbindungsregion mit einer dazwischengeschalteten cystein-freien Linkerregion. Die Bindung von fünf zweiwertigen Metallionen (hauptsächlich Zn2+- und Cd2+-Ionen) an die 14 Thiolatgruppen der Cysteine führt zu einem einzelnen Metall-Thiolat-Cluster. Jüngste Studien zeigen die zusätzliche Koordination von Sulfidionen im Metall-Thiolat-Cluster von cicMT2. Obwohl die Anwesenheit von Sulfidionen schon früher nachgewiesen wurde, sind noch viele Details unklar. Die weitere in vitro Charakterisierung konnte die Eigenschaften des Clusters bezüglich ein- und zweiwertiger Metallionen, Stabilität, Sulfid-moduliertem Anstieg der Clustergrösse, den Einfluss der Umgebung auf die verschiedenen Isoformen und den Mechanismus der Aufnahme selbst aufklären. Von unseren Resultaten können wir auf die starke Abhängigkeit der Sulfid-Aufnahme von der Metall- und Sulfidionen-Verfügbarkeit schliessen. Während mit zweiwertigen Metallionen die Sulfid-Aufnahme klar bestätigt werden konnte, wurde mit einwertigen Metallionen zwar eine Änderung in der Cluster-Struktur gezeigt, jedoch verbunden mit offenen Fragen zu den spezifischen Eigenschaften. Die anfängliche Konzentration an frei verfügbaren Sulfidionen bestimmt die Grösse des Cadmium-Sulfid-Thiolate-Clusters. Im Falle von cicMT2 konnte gezeigt werden, dass der Cluster in Gegenwart von Sulfidionen signifikant mehr Metallionen binden kann als in ihrer Abwesenheit. Die Untersuchung des Bildungsmechanismus des Sulfidionen enthaltenden Clusters zeigt eine Sulfid-induzierte geringe Verformung oder Öffnung der vorhandenen Clusterstruktur vor dem Einbau zusätzlicher Metallionen. Um die prinzipielle Existenz von Sulfid-enthaltenden Metall-Thiolat-Clustern in MTs abzuschätzen, wurden analoge Experimente mit Säugetier-Metallothioninen durchgeführt, die eine mögliche Rolle des langen cystein-freien Linkers in gewissen pflanzlichen MTs aufdeckten. Des Weiteren gab es Bestrebungen, die dreidimensionale Struktur des cicMT2 mit Kernspinresonanzspektroskopie zu untersuchen. Die Spektren lieferten Hinweise auf intrinsische ungeordnete Strukturen, die durchaus von Bedeutung für die funktionellen Interaktionen mit den Metallionen sein könnten. Neben den strukturellen Analysen bezüglich cicMT2 versuchten wir, die Funktion von einer Vielfalt pflanzlicher MTs mit der Komplementierung von Hefen zu untersuchen, was allerdings nicht abgeschlossen werden konnte. Alles in allem konnten wir Licht auf verschiedene Aspekte der pflanzlichen Metallothionine werfen, es liegen jedoch noch immer viele Facetten im Dunkeln verborgen.

Abstract

Summary Metallothioneins (MTs) are small cysteine-rich proteins coordinating various transition metal ions preferably with the electron configuration d10. They are ubiquitously present in most phyla, and next to phytochelatins they represent a successful molecular concept for metal complexation in cells. Although MTs have been studied for decades still limited information is available. Especially plant MTs are not examined sufficiently, neither in structural nor in functional aspects. This study deals mainly with elucidating the structural and functional characteristics of the plant MT2 (cicMT2) from chickpea (Cicer arietinum). As a typical member of the plant MT subgroup p2, it has an N- and C-terminal metal binding region with a long cysteine-devoid linker region in between. The binding of five divalent metal ions (mainly Zn2+ and Cd2+ ions) to the 14 thiolate groups of the cysteines leads to a single metal-thiolate cluster. Recent studies showed the incorporation of sulfide ions into the metal-thiolate cluster of cicMT2. Although the presence of sulfide ions in plant and other MTs has already been reported previously, many details remained unclear. The further in vitro characterization with various analytical techniques could enlighten the features of the cluster in terms of mono- and divalent metal ions, stability, sulfide-modulated increase in cluster size, the influence of the environment on the various isoforms, and the mechanism of the incorporation itself. From our findings we can conclude that sulfide ion incorporation is highly influenced by the metal ion and sulfide ion availability in the experimental setup. While a clear incorporation of sulfide ions can be shown with divalent metal ions, also a change in cluster structure can be reported for monovalent metal ions but its specific features are still under discussion. The size of the cadmium-sulfide-thiolate cluster shows a dependence on the initial available free sulfide ion concentration. In case of cicMT2, the cluster can be enlarged to a multiple size of the one without sulfide ions. Evaluation of the mechanism of sulfide containing Cd2+-thiolate cluster formation reveals a slight distortion or opening of the preformed cluster structure by sulfide ions prior to insertion of additional metal ions into the cluster. To probe the general ability of metallothioneins to form sulfide containing metal-thiolate clusters, analogous experiments were performed with a mammalian MT revealing a probable role of the long cysteine- free linker region present in most plant MTs. Further, determination of the overall 3D structure of cicMT2 was attempted by nuclear magnetic resonance spectroscopy. The obtained spectra indicate intrinsically disordered structures, which might however even be favorable for the metal related function of the protein. Next to the structural features of cicMT2, the function of a variety of plant MTs was approached with yeast complementation assays. These experiments will require further efforts. All in all, we elaborated different aspects of plant metallothioneins, yet a lot of facets are hidden in the dark. Zusammenfassung Metallothionine (MTs) sind kleine cystein-reiche Proteine, die bevorzugt Übergangsmetalle mit einer d10 Elektronenkonfiguration binden. Sie kommen in einem grossen Teil der bekannten Lebensformen vor und repräsentieren neben den Phytochelatinen ein erfolgreiches molekulares Konzept für die Metallkomplexierung in Zellen. Obwohl MTs seit Jahrzehnten studiert werden, sind die vorhandenen Informationen immer noch beschränkt. Insbesondere die pflanzlichen MTs sind wenig untersucht, weder in struktureller noch funktioneller Hinsicht. Diese Studie behandelt hauptsächlich strukturelle und funktionelle Aspekte des pflanzlichen MT2 (cicMT2) der Kichererbse (Cicer arietinum). Als typisches Mitglied der pflanzlichen MT-Untergruppe p2 hat cicMT2 eine N- und C-terminale Metallbindungsregion mit einer dazwischengeschalteten cystein-freien Linkerregion. Die Bindung von fünf zweiwertigen Metallionen (hauptsächlich Zn2+- und Cd2+-Ionen) an die 14 Thiolatgruppen der Cysteine führt zu einem einzelnen Metall-Thiolat-Cluster. Jüngste Studien zeigen die zusätzliche Koordination von Sulfidionen im Metall-Thiolat-Cluster von cicMT2. Obwohl die Anwesenheit von Sulfidionen schon früher nachgewiesen wurde, sind noch viele Details unklar. Die weitere in vitro Charakterisierung konnte die Eigenschaften des Clusters bezüglich ein- und zweiwertiger Metallionen, Stabilität, Sulfid-moduliertem Anstieg der Clustergrösse, den Einfluss der Umgebung auf die verschiedenen Isoformen und den Mechanismus der Aufnahme selbst aufklären. Von unseren Resultaten können wir auf die starke Abhängigkeit der Sulfid-Aufnahme von der Metall- und Sulfidionen-Verfügbarkeit schliessen. Während mit zweiwertigen Metallionen die Sulfid-Aufnahme klar bestätigt werden konnte, wurde mit einwertigen Metallionen zwar eine Änderung in der Cluster-Struktur gezeigt, jedoch verbunden mit offenen Fragen zu den spezifischen Eigenschaften. Die anfängliche Konzentration an frei verfügbaren Sulfidionen bestimmt die Grösse des Cadmium-Sulfid-Thiolate-Clusters. Im Falle von cicMT2 konnte gezeigt werden, dass der Cluster in Gegenwart von Sulfidionen signifikant mehr Metallionen binden kann als in ihrer Abwesenheit. Die Untersuchung des Bildungsmechanismus des Sulfidionen enthaltenden Clusters zeigt eine Sulfid-induzierte geringe Verformung oder Öffnung der vorhandenen Clusterstruktur vor dem Einbau zusätzlicher Metallionen. Um die prinzipielle Existenz von Sulfid-enthaltenden Metall-Thiolat-Clustern in MTs abzuschätzen, wurden analoge Experimente mit Säugetier-Metallothioninen durchgeführt, die eine mögliche Rolle des langen cystein-freien Linkers in gewissen pflanzlichen MTs aufdeckten. Des Weiteren gab es Bestrebungen, die dreidimensionale Struktur des cicMT2 mit Kernspinresonanzspektroskopie zu untersuchen. Die Spektren lieferten Hinweise auf intrinsische ungeordnete Strukturen, die durchaus von Bedeutung für die funktionellen Interaktionen mit den Metallionen sein könnten. Neben den strukturellen Analysen bezüglich cicMT2 versuchten wir, die Funktion von einer Vielfalt pflanzlicher MTs mit der Komplementierung von Hefen zu untersuchen, was allerdings nicht abgeschlossen werden konnte. Alles in allem konnten wir Licht auf verschiedene Aspekte der pflanzlichen Metallothionine werfen, es liegen jedoch noch immer viele Facetten im Dunkeln verborgen.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Freisinger Eva
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2013
Deposited On:09 Apr 2019 12:51
Last Modified:07 Apr 2020 07:17
Number of Pages:164
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod009962038&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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