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Regulation of kidney distal convoluted tubule (DTC) cell function


Trompf, Katja. Regulation of kidney distal convoluted tubule (DTC) cell function. 2013, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary The distal convoluted tubule (DCT) plays an important role in the regulation of Na+ homeostasis and blood pressure. Furthermore, the DCT is responsible for the fine‐tuning of renal Ca++, Mg++ and K+ excretion. The DCT has also a remarkable structural plasticity, which contributes to its functional adaptation to altered ion transport requirements. The thiazide‐sensitive Na+Cl‐ co‐transporter (NCC) is the major apical Na+ transport pathway in the DCT. NCC activity and DCT salt transport are regulated by the tubular Na+ load, dietary ion intake, metabolic alkalosis and acidosis as well as by many hormones including aldosterone, angiotensin II, and vasopressin. The functional significance of the DCT and NCC is evidenced by the fact that the DCT is an important target of diuretics and that monogenic diseases with NCC dysfunction (i.e. Gitelman and Gordon syndrome) profoundly alter blood pressure. The identification of the With No lysine (K) kinases (WNK) as important regulators of NCC phosphorylation and activity was a major step towards the understanding of the molecular mechanisms controlling DCT function. Nevertheless, we still know very little about the regulatory mechanisms that interfere with the WNK‐pathway or that otherwise regulate NCC and DCT ion transport. Based on the fact that many of the so far described NCC‐regulating proteins (e.g., kidney specific‐WNK1, WNK4, STE20/SPS1‐related proline/alanine‐rich kinase (SPAK), Kelch‐like 3 Protein (Klhl3) or parvalbumin (PV)) are enriched in the DCT, we hypothesized that the DCT expresses a specific repertoire of regulatory proteins that control its function. In a recent screen by group, two gene products were found to be highly enriched in the DCT, i.e., the Ppp1r1a gene encoding for the protein phosphatase inhibitor 1 (I1) and the Prkcµ gene encoding for protein kinase D1 (PKD1). The aim of the present thesis was to investigate the role of I1 and PKD1 for the regulation of NCC activity and DCT function using appropriate gene‐modified mouse models. Moreover, transcriptomic analyses on isolated DCTs were used to identify novel regulators that contribute to the remarkable structural plasticity of the DCT. Furthermore, a protocol for primary DCT cell culture was established. First, siRNA‐mediated knockdown experiments in HEK293 cells overexpressing NCC were used to study the role of the phosphatase inhibitor I1 for NCC regulation. Knockdown of I1 caused a pronounced reduction of NCC phosphorylation, while the total expression of NCC remained unchanged. Co‐expression of I1 with NCC in Xenopus laevis oocytes increased thiazide‐dependent Na+ uptake providing further in vitro evidence that I1 regulates NCC. To assess the functional role of I1 in vivo, I1 knockout mice (I1‐KO) were studied. Similar to the findings in HEK293 cells, I1‐KO mice exhibited an approximately 50 % reduction in NCC phosphorylation without any changes in total NCC abundance. Compared with wildtype mice, I1‐KO mice did not show any differences in urinary ion excretion, plasma ion, and plasma aldosterone concentrations. However, on a low K+ diet, I1‐KO mice had lower plasma K+ levels than their corresponding wildtype littermates. Moreover, compared with wildtype mice, I1‐KO mice showed a reduced arterial blood pressure on standard and low salt diet, but not on a high salt diet. Thus, I1 regulates NCC phosphorylation in heterologous expression systems and in the DCT in vivo and it controls arterial blood pressure in mice. Next, we studied the role of PKD1 for NCC regulation. Immunohistochemistry confirmed that PKD1 is highly expressed in mouse and rat DCT. In adrenalectomized rats, a single aldosterone injection rapidly (<2h) increased total and phosphorylated PKD1 specifically in the DCT. The induction of PKD1 went along with an enhanced phosphorylation of NCC. Conversely, aldosterone synthase‐ deficient mice lacking any endogenous aldosterone production, showed decreased PKD1 mRNA and protein abundance, PKD1 phosphorylation and NCC phosphorylation. To further investigate the role of PKD1 in the DCT in vivo, we generated mice with a specific deletion of PKD1 in the early DCT (PKD1‐KO) by breeding PKD1flox/flox mice with mice expressing cre under the control of the DCT‐ specific parvalbumin promoter (PV‐cre mice). PKD1‐KO mice showed a profound reduction in NCC phosphorylation without any effect on total NCC abundance. Urinary ion excretions and plasma ion concentrations were not different between PKD1‐KO and control mice. However, urinary aldosterone excretion was increased in PKD1‐KO mice suggesting a mild urinary salt wasting phenotype. Consistently, with the elevated aldosterone levels, PKD1‐KO mice exhibited an up‐regulation of the epithelial sodium channel ENaC in the renal collecting system. Blood pressure of PKD1‐KO animals on a low Na+ diet was decreased in comparison to control animals. Thus, PKD1 is another DCT‐enriched gene product that controls both NCC phosphorylation and arterial blood pressure. Interestingly, altered NCC and hence DCT Na+‐transport activity are often associated with marked structural changes to the DCT epithelium. For example, enhanced salt transport usually goes along with hypertrophy and hyperplasia while lowered transport rates are associated with atrophy or even apoptosis of the DCT cells. To identify underlying molecular mechanisms in mice, we stimulated and inhibited DCT cell growth by pharmacological interventions (i.e. furosemide and thiazide treatment). Subsequently, we used fluorescence‐activated renal tubule sorting (complex object and parametric analysis and sorting ‐ COPAS) to isolate green fluorescent DCTs for differential microarray analysis. More than 500 genes were found to be differently regulated within 4 h after furosemide or thiazide treatment. Four potentially relevant genes were selected and their differential regulation was confirmed by quantitative RT‐PCR (i.e, the transient receptor potential melastatin 6 channel (TRPM6), the salt inducible kinase 1 (SIK1), the cation transport regulator (Chac1) and the transcription factor, Prox1). Further experiments will have to address the specific roles of these differently regulated genes for DCT growth and function. As an appropriate DCT cell model is lacking, we also aimed at developing a DCT cell culture system in which the function of target genes can be studied in an ex vivo setting. Therefore, we used the COPAS technique to isolate DCTs in large scale from transgenic mice expressing eGFP specifically in the early DCT (PV‐EGFP mice). DCTs were sorted in cell culture dishes and on permeable filter supports to allow an outgrowth of DCT cells under cell culture conditions. After 10 days, outgrowing DCT cells formed a polarized epithelium with a sizeable transepithelial resistance. qRT‐PCR and immunocytochemistry confirmed that the outgrown DCT cells maintained many DCT cell characteristics including NCC and WNK1 expression. However, the level of NCC expression was drastically reduced compared with the in vivo conditions and it was too low for biochemical studies. Hence, additional work is needed to further optimize the cell culture conditions. Taken together, our data support the hypothesis that the DCT has a specific repertoire of proteins that regulate its function. Two novel candidate genes (i.e. I1 and PKD1) that control NCC function and blood pressure were identified and studied in appropriate gene‐modified mouse models. Moreover, several new candidate genes that potentially contribute to the marked structural plasticity of the DCT have been identified. Furthermore, a protocol for primary DCT cell cultures from wildtype and transgenic mice was established, which may allow to test for the functional significance of target genes in ex vivo conditions. Thus, this thesis provides several novel insights into the molecular mechanism of NCC regulation and blood pressure control. Novel data and tools were established, which will facilitate future experiment elucidating DCT function. Zusammenfassung Die pars convoluta des distalen Tubulus (DCT) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Natriumhomöostase und des Blutdrucks. Ausserdem ist der DCT für die Feineinstellung der renalen Ca++‐, Mg++‐ und K+‐Ausscheidung verantwortlich. Seine außerordentliche strukturelle Plastizität trägt dabei zur funktionellen Anpassung an veränderten Bedingungen bei. Der Thiazid‐sensitive Na+Cl‐‐Co‐ Transporter (NCC) ist der wichtigste apikale Na+‐Transporter im DCT. Die Aktivität von NCC und der Salztransport im DCT werden durch die tubuläre Salzfracht, den Salzgehalt der Nahrung, den Säure‐ Basen‐Haushalt, sowie durch eine Reihe von Hormonen wie Aldosteron, Angiotensin II und Vasopressin reguliert. Die funktionelle Bedeutung des DCT und des NCC wird daraus deutlich, dass der DCT ein wichtiger Angriffspunkt für Diuretika ist und dass monogenische Erkrankungen mit NCC‐ Dysfunktion (d.h. Gitelman‐ und Gordon‐Syndrom) den Blutdruck stark verändern. Die Identifizierung der With No lysine (K) Kinases (WNK) als wichtige Regulatoren der NCC‐ Phosphorylierung und damit der NCC‐Aktivität war ein entscheidender Schritt zum Verständnis molekularer Mechanismen, die die DCT‐Funktion kontrollieren. Dennoch wissen wir noch sehr wenig über die regulatorischen Mechanismen, die mit dem WNK‐Signalweg interferieren und/oder den NCC‐ und DCT‐Ionentransport steuern. Ausgehend von der Tatsache, dass viele der bislang beschriebenen NCC regulierenden Proteine (z.B. WNK1 (nierenspezifisch), WNK4, STE20/SPS1‐related proline/alanine‐rich kinase (SPAK), Kelch‐like 3 Protein (Klhl3) oder Parvalbumin (PV)) besonders im DCT angereichert sind, stellten wir die Hypothese auf, dass der DCT ein spezifisches Repertoire an regulatorischen Proteinen besitzt, die seine Funktion steuern. In einer Screening‐Untersuchung an isolierten DCTs, die unsere Gruppe kürzlich durchgeführt hat, wurden zwei Gene identifiziert, die im DCT stark exprimiert sind, das Ppp1r1a‐Gen, kodierend für den Phosphatase‐Inhibitor 1, und das Prkcµ‐Gen, kodierend für die Proteinkinase D1. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Rolle von I1 und PKD1 in der Regulation der NCC‐Aktivität und der DCT‐Funktion mit geeigneten genveränderten Mausmodellen zu untersuchen. Darüber hinaus wurden Transkriptom‐Analysen an isolierten DCTs verwendet, um neue Regulatoren der strukturellen Plastizität des DCT zu identifizieren. Weiterhin wurde ein Protokoll für primäre DCT‐Zellkulturen entwickelt. Um die Rolle des Phosphatase‐Inhibitors 1 (I1), bei der NCC‐Regulation zu analysieren, wurden zunächst siRNA‐vermittelte Knockdown‐Experimente in NCC‐überexprimierenden HEK293‐ Zellen durchgeführt. Der Knockdown von I1 führte zu einer ausgeprägten Reduzierung der NCC‐ Phosphorylierung, während die totale NCC‐Expression unverändert blieb. Die Co‐Expression von I1 mit NCC in Xenopus laevis Oozyten erhöhte die Thiazid‐abhängige Na+‐Aufnahme. Dies ist ein weiterer in vitro‐Nachweis, dass I1 NCC reguliert. Um die funktionelle Rolle von I1 in vivo zu beurteilen, wurden I1‐Knockout‐Mäuse (I1‐KO) untersucht. In Analogie zu den Ergebnissen in HEK293‐Zellen zeigten I1‐KO‐Mäuse eine etwa 50%ige Reduktion der NCC‐Phosphorylierung ohne Veränderungen der gesamten NCC‐Expression. Im Vergleich zu Wildtyp‐Mäusen ergaben sich in I1‐ KO‐Mäusen keine Unterschiede in der renalen Ionenausscheidung und in den Plasmaionen‐und Plasmaaldosteron‐Konzentrationen. Allerdings wiesen I1‐KO Mäuse unter K+‐armer Diät eine niedrigere Plasma K+‐Konzentration als ihre entsprechenden Wildtyp‐Geschwister auf. Zudem fand sich bei I1‐KO‐Mäusen im Vergleich zu Wildtyp‐Mäusen ein verminderter arterieller Blutdruck sowohl unter Standard‐ als auch unter salzarmer Diät, nicht aber unter einer Hochsalzdiät. Zusammengefasst konnten wir zeigen, dass I1 die Phosphorylierung von NCC sowohl in heterologen Expressionssystemen als auch im DCT in vivo reguliert, und dass I1 bei Mäusen den arteriellen Blutdruck steuert. In einem nächsten Schritt untersuchten wir die Rolle von PKD1 in der Regulierung von NCC. Immunohistochemische Analysen bestätigten, dass PKD1 im DCT von Mäusen und Ratten stark exprimiert ist. In adrenalektomierten Ratten erhöhte eine einzelne Injektion von Aldosteron (<2h) rasch sowohl die Gesamtexpression wie auch die Phosphorylierung von PKD1 im DCT. Die Induktion von PKD1 ging mit einer verstärkten Phosphorylierung von NCC einher. Umgekehrt zeigten Aldosteronsynthase‐defiziente Mäuse, die keine endogene Aldosteron‐Produktion besitzen, eine Verminderung der PKD1‐mRNA‐Konzentration und ‐Proteinexpression sowie eine Verminderung der Phosphorylierung von PKD1 und NCC. Zur weiteren Untersuchung der Rolle von PKD1 im DCT in vivo generierten wir Mäuse mit einer spezifischen Deletion von PKD1 im frühen DCT (PKD1‐KO) durch die Kreuzung von PKD1flox/flox‐Mäusen mit Mäusen, die cre unter der Kontrolle des DCT‐spezifischen Parvalbumin‐Promotors exprimieren (PV‐cre‐Mäuse). PKD1‐KO Mäuse zeigten eine geringere NCC‐ Phosphorylierung ohne dass dabei die Gesamtexpression von NCC verändert war. Bezüglich der renalen Ionenausscheidung sowie der Plasmaionenkonzentration unterschieden sich die PKD1‐KO Tiere nicht von ihren Kontroll‐Geschwistern. Allerdings war die renale Aldosteron‐Ausscheidung in PKD1‐KO‐Mäusen erhöht, was auf einen milden renalen Salzverlust hinweist. In Übereinstimmung mit den erhöhten Aldosteronwerten wiesen die PKD1‐KO Mäuse eine erhöhte Expression des epithelialen Natrium‐Kanals, ENaC, im Sammelrohrsystem auf. Unter salzarmer Diät war der Blutdruck der PKD1‐KO‐Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren verringert. Daraus schlossen wir, dass PKD1 ein weiteres DCT‐angereichertes Genprodukt ist, das sowohl die NCC‐Phosphorylierung als auch den arteriellen Blutdruck steuert. Interessanterweise sind Veränderungen in der NCC‐Aktivität und damit des DCT‐ Natriumtransportes häufig mit einer ausgeprägten strukturellen Veränderung des DCT‐Epithels assoziiert. So geht ein verstärkter Salztransport im DCT beispielsweise mit eine Hypertrophie und Hyperplasie der DCT‐Zellen einher, während bei einem verminderten Salztransport das Segment atrophiert oder sogar eine Apoptose der DCT‐Zellen auftreten kann. Um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen für diese Plastizität des DCTs bei Mäusen zu identifizieren, stimulierten bzw. inhibierten wir das DCT‐Zellwachstum durch verschiedene pharmakologische Interventionen (d.h. Furosemid‐ und Thiazid‐Behandlung). Anschließend verwendeten wir die Fluoreszenz‐aktivierte Sortierung‐mehrzelliger Objekte (complex object and parametric analysis and sorting ‐ COPAS) um grün fluoreszierende DCTs zu isolieren welche dann für die differentielle Microarray‐Analyse aufbereitet wurden. Mehr als 500 unterschiedlich regulierte Gene wurden nach vierstündiger Furosemid‐ oder Thiazid‐Behandlung gefunden. Vier potenziell relevante Gene wurden ausgewählt und ihre differentielle Regulation mittels quantitativer RT‐PCR bestätigt: transientes Rezeptor‐ Potential‐Melastatin 6‐Kanal (TRPM6), Salz‐induzierbare Kinase 1 (SIK1), Kationentransport‐Regler (Chac1) und Transkriptions‐Faktor Prox1. Die spezifischen Rollen dieser unterschiedlich regulierten Gene für DCT‐Wachstum und ‐Funktion muss in weiteren Experimenten untersucht werden. Mangels eines geeigneten DCT‐Zellmodells war es ein weiteres Ziel, ein DCT‐Zellkultursystem zu entwickeln, in dem die Funktion von Zielgenen ex vivo analysiert werden kann. Wir setzten die COPAS‐Technik ein, um in großem Maßstab DCTs aus transgenen Mäusen, die eGFP spezifisch im DCT1 exprimieren (PV‐eGFP‐Mäuse), zu isolieren. Die isolierten DCTs wurden in Zellkulturschalen und auf semipermeablen Filter sortiert, um ein Wachstum unter Zellkultur‐Bedingungen zu ermöglichen. Nach 10 Tagen in Kultur bildeten die DCT‐Zellen ein dichtes, polarisiertes Epithel mit einem beträchtlichen transepithelialen Widerstand. qRT‐PCR und Immunozytochemie bestätigten, dass die herangewachsenen Zellen viele DCT‐Zelleigenschaften einschließlich der Expression von NCC und WNK1 beibehielten. Allerdings war die NCC‐Expression im Vergleich zu in vivo‐Bedingungen so stark reduziert, dass biochemische Analysen nicht mehr möglich waren. Eine weiterführende Optimierung der Zellkultur‐Bedingungen ist notwendig um ein zuverlässiges, DCT‐spezifisches in vitro System zu generieren. Zusammenfassend unterstützen unsere Daten die Hypothese, dass der DCT über ein spezifisches Repertoire an Proteinen verfügt, die seine Funktion gezielt regulieren. Für zwei dieser Proteine (I1 und PKD1), konnte gezeigt werden, dass sie in die Regulierung der Funktion von NCC und des Blutdruck involviert sind. Weiter wurde die Bedeutung diese Proteine in entsprechenden Gen‐veränderten Mausmodellen studiert. Bezüglich der Regulierung der strukturellen Plastizität des DCTs konnten mehrere neue Kandidatengene, identifiziert werden. Weiterhin wurde ein Protokoll zur Gewinnung primärer DCT‐Zellkulturen aus Wildtyp‐ und transgenen Mäusen etabliert, das die Testung der funktionellen Bedeutung von Zielgenen ex vivo ermöglicht. Diese Arbeit liefert somit neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der NCC‐Regulierung und der Kontrolle des Blutdrucks. Darüber hinaus stellt sie neue Daten und Werkzeuge vor, welche für die zukünftige Erforschung der Funktion des DCT relevant sind.

Abstract

Summary The distal convoluted tubule (DCT) plays an important role in the regulation of Na+ homeostasis and blood pressure. Furthermore, the DCT is responsible for the fine‐tuning of renal Ca++, Mg++ and K+ excretion. The DCT has also a remarkable structural plasticity, which contributes to its functional adaptation to altered ion transport requirements. The thiazide‐sensitive Na+Cl‐ co‐transporter (NCC) is the major apical Na+ transport pathway in the DCT. NCC activity and DCT salt transport are regulated by the tubular Na+ load, dietary ion intake, metabolic alkalosis and acidosis as well as by many hormones including aldosterone, angiotensin II, and vasopressin. The functional significance of the DCT and NCC is evidenced by the fact that the DCT is an important target of diuretics and that monogenic diseases with NCC dysfunction (i.e. Gitelman and Gordon syndrome) profoundly alter blood pressure. The identification of the With No lysine (K) kinases (WNK) as important regulators of NCC phosphorylation and activity was a major step towards the understanding of the molecular mechanisms controlling DCT function. Nevertheless, we still know very little about the regulatory mechanisms that interfere with the WNK‐pathway or that otherwise regulate NCC and DCT ion transport. Based on the fact that many of the so far described NCC‐regulating proteins (e.g., kidney specific‐WNK1, WNK4, STE20/SPS1‐related proline/alanine‐rich kinase (SPAK), Kelch‐like 3 Protein (Klhl3) or parvalbumin (PV)) are enriched in the DCT, we hypothesized that the DCT expresses a specific repertoire of regulatory proteins that control its function. In a recent screen by group, two gene products were found to be highly enriched in the DCT, i.e., the Ppp1r1a gene encoding for the protein phosphatase inhibitor 1 (I1) and the Prkcµ gene encoding for protein kinase D1 (PKD1). The aim of the present thesis was to investigate the role of I1 and PKD1 for the regulation of NCC activity and DCT function using appropriate gene‐modified mouse models. Moreover, transcriptomic analyses on isolated DCTs were used to identify novel regulators that contribute to the remarkable structural plasticity of the DCT. Furthermore, a protocol for primary DCT cell culture was established. First, siRNA‐mediated knockdown experiments in HEK293 cells overexpressing NCC were used to study the role of the phosphatase inhibitor I1 for NCC regulation. Knockdown of I1 caused a pronounced reduction of NCC phosphorylation, while the total expression of NCC remained unchanged. Co‐expression of I1 with NCC in Xenopus laevis oocytes increased thiazide‐dependent Na+ uptake providing further in vitro evidence that I1 regulates NCC. To assess the functional role of I1 in vivo, I1 knockout mice (I1‐KO) were studied. Similar to the findings in HEK293 cells, I1‐KO mice exhibited an approximately 50 % reduction in NCC phosphorylation without any changes in total NCC abundance. Compared with wildtype mice, I1‐KO mice did not show any differences in urinary ion excretion, plasma ion, and plasma aldosterone concentrations. However, on a low K+ diet, I1‐KO mice had lower plasma K+ levels than their corresponding wildtype littermates. Moreover, compared with wildtype mice, I1‐KO mice showed a reduced arterial blood pressure on standard and low salt diet, but not on a high salt diet. Thus, I1 regulates NCC phosphorylation in heterologous expression systems and in the DCT in vivo and it controls arterial blood pressure in mice. Next, we studied the role of PKD1 for NCC regulation. Immunohistochemistry confirmed that PKD1 is highly expressed in mouse and rat DCT. In adrenalectomized rats, a single aldosterone injection rapidly (<2h) increased total and phosphorylated PKD1 specifically in the DCT. The induction of PKD1 went along with an enhanced phosphorylation of NCC. Conversely, aldosterone synthase‐ deficient mice lacking any endogenous aldosterone production, showed decreased PKD1 mRNA and protein abundance, PKD1 phosphorylation and NCC phosphorylation. To further investigate the role of PKD1 in the DCT in vivo, we generated mice with a specific deletion of PKD1 in the early DCT (PKD1‐KO) by breeding PKD1flox/flox mice with mice expressing cre under the control of the DCT‐ specific parvalbumin promoter (PV‐cre mice). PKD1‐KO mice showed a profound reduction in NCC phosphorylation without any effect on total NCC abundance. Urinary ion excretions and plasma ion concentrations were not different between PKD1‐KO and control mice. However, urinary aldosterone excretion was increased in PKD1‐KO mice suggesting a mild urinary salt wasting phenotype. Consistently, with the elevated aldosterone levels, PKD1‐KO mice exhibited an up‐regulation of the epithelial sodium channel ENaC in the renal collecting system. Blood pressure of PKD1‐KO animals on a low Na+ diet was decreased in comparison to control animals. Thus, PKD1 is another DCT‐enriched gene product that controls both NCC phosphorylation and arterial blood pressure. Interestingly, altered NCC and hence DCT Na+‐transport activity are often associated with marked structural changes to the DCT epithelium. For example, enhanced salt transport usually goes along with hypertrophy and hyperplasia while lowered transport rates are associated with atrophy or even apoptosis of the DCT cells. To identify underlying molecular mechanisms in mice, we stimulated and inhibited DCT cell growth by pharmacological interventions (i.e. furosemide and thiazide treatment). Subsequently, we used fluorescence‐activated renal tubule sorting (complex object and parametric analysis and sorting ‐ COPAS) to isolate green fluorescent DCTs for differential microarray analysis. More than 500 genes were found to be differently regulated within 4 h after furosemide or thiazide treatment. Four potentially relevant genes were selected and their differential regulation was confirmed by quantitative RT‐PCR (i.e, the transient receptor potential melastatin 6 channel (TRPM6), the salt inducible kinase 1 (SIK1), the cation transport regulator (Chac1) and the transcription factor, Prox1). Further experiments will have to address the specific roles of these differently regulated genes for DCT growth and function. As an appropriate DCT cell model is lacking, we also aimed at developing a DCT cell culture system in which the function of target genes can be studied in an ex vivo setting. Therefore, we used the COPAS technique to isolate DCTs in large scale from transgenic mice expressing eGFP specifically in the early DCT (PV‐EGFP mice). DCTs were sorted in cell culture dishes and on permeable filter supports to allow an outgrowth of DCT cells under cell culture conditions. After 10 days, outgrowing DCT cells formed a polarized epithelium with a sizeable transepithelial resistance. qRT‐PCR and immunocytochemistry confirmed that the outgrown DCT cells maintained many DCT cell characteristics including NCC and WNK1 expression. However, the level of NCC expression was drastically reduced compared with the in vivo conditions and it was too low for biochemical studies. Hence, additional work is needed to further optimize the cell culture conditions. Taken together, our data support the hypothesis that the DCT has a specific repertoire of proteins that regulate its function. Two novel candidate genes (i.e. I1 and PKD1) that control NCC function and blood pressure were identified and studied in appropriate gene‐modified mouse models. Moreover, several new candidate genes that potentially contribute to the marked structural plasticity of the DCT have been identified. Furthermore, a protocol for primary DCT cell cultures from wildtype and transgenic mice was established, which may allow to test for the functional significance of target genes in ex vivo conditions. Thus, this thesis provides several novel insights into the molecular mechanism of NCC regulation and blood pressure control. Novel data and tools were established, which will facilitate future experiment elucidating DCT function. Zusammenfassung Die pars convoluta des distalen Tubulus (DCT) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Natriumhomöostase und des Blutdrucks. Ausserdem ist der DCT für die Feineinstellung der renalen Ca++‐, Mg++‐ und K+‐Ausscheidung verantwortlich. Seine außerordentliche strukturelle Plastizität trägt dabei zur funktionellen Anpassung an veränderten Bedingungen bei. Der Thiazid‐sensitive Na+Cl‐‐Co‐ Transporter (NCC) ist der wichtigste apikale Na+‐Transporter im DCT. Die Aktivität von NCC und der Salztransport im DCT werden durch die tubuläre Salzfracht, den Salzgehalt der Nahrung, den Säure‐ Basen‐Haushalt, sowie durch eine Reihe von Hormonen wie Aldosteron, Angiotensin II und Vasopressin reguliert. Die funktionelle Bedeutung des DCT und des NCC wird daraus deutlich, dass der DCT ein wichtiger Angriffspunkt für Diuretika ist und dass monogenische Erkrankungen mit NCC‐ Dysfunktion (d.h. Gitelman‐ und Gordon‐Syndrom) den Blutdruck stark verändern. Die Identifizierung der With No lysine (K) Kinases (WNK) als wichtige Regulatoren der NCC‐ Phosphorylierung und damit der NCC‐Aktivität war ein entscheidender Schritt zum Verständnis molekularer Mechanismen, die die DCT‐Funktion kontrollieren. Dennoch wissen wir noch sehr wenig über die regulatorischen Mechanismen, die mit dem WNK‐Signalweg interferieren und/oder den NCC‐ und DCT‐Ionentransport steuern. Ausgehend von der Tatsache, dass viele der bislang beschriebenen NCC regulierenden Proteine (z.B. WNK1 (nierenspezifisch), WNK4, STE20/SPS1‐related proline/alanine‐rich kinase (SPAK), Kelch‐like 3 Protein (Klhl3) oder Parvalbumin (PV)) besonders im DCT angereichert sind, stellten wir die Hypothese auf, dass der DCT ein spezifisches Repertoire an regulatorischen Proteinen besitzt, die seine Funktion steuern. In einer Screening‐Untersuchung an isolierten DCTs, die unsere Gruppe kürzlich durchgeführt hat, wurden zwei Gene identifiziert, die im DCT stark exprimiert sind, das Ppp1r1a‐Gen, kodierend für den Phosphatase‐Inhibitor 1, und das Prkcµ‐Gen, kodierend für die Proteinkinase D1. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Rolle von I1 und PKD1 in der Regulation der NCC‐Aktivität und der DCT‐Funktion mit geeigneten genveränderten Mausmodellen zu untersuchen. Darüber hinaus wurden Transkriptom‐Analysen an isolierten DCTs verwendet, um neue Regulatoren der strukturellen Plastizität des DCT zu identifizieren. Weiterhin wurde ein Protokoll für primäre DCT‐Zellkulturen entwickelt. Um die Rolle des Phosphatase‐Inhibitors 1 (I1), bei der NCC‐Regulation zu analysieren, wurden zunächst siRNA‐vermittelte Knockdown‐Experimente in NCC‐überexprimierenden HEK293‐ Zellen durchgeführt. Der Knockdown von I1 führte zu einer ausgeprägten Reduzierung der NCC‐ Phosphorylierung, während die totale NCC‐Expression unverändert blieb. Die Co‐Expression von I1 mit NCC in Xenopus laevis Oozyten erhöhte die Thiazid‐abhängige Na+‐Aufnahme. Dies ist ein weiterer in vitro‐Nachweis, dass I1 NCC reguliert. Um die funktionelle Rolle von I1 in vivo zu beurteilen, wurden I1‐Knockout‐Mäuse (I1‐KO) untersucht. In Analogie zu den Ergebnissen in HEK293‐Zellen zeigten I1‐KO‐Mäuse eine etwa 50%ige Reduktion der NCC‐Phosphorylierung ohne Veränderungen der gesamten NCC‐Expression. Im Vergleich zu Wildtyp‐Mäusen ergaben sich in I1‐ KO‐Mäusen keine Unterschiede in der renalen Ionenausscheidung und in den Plasmaionen‐und Plasmaaldosteron‐Konzentrationen. Allerdings wiesen I1‐KO Mäuse unter K+‐armer Diät eine niedrigere Plasma K+‐Konzentration als ihre entsprechenden Wildtyp‐Geschwister auf. Zudem fand sich bei I1‐KO‐Mäusen im Vergleich zu Wildtyp‐Mäusen ein verminderter arterieller Blutdruck sowohl unter Standard‐ als auch unter salzarmer Diät, nicht aber unter einer Hochsalzdiät. Zusammengefasst konnten wir zeigen, dass I1 die Phosphorylierung von NCC sowohl in heterologen Expressionssystemen als auch im DCT in vivo reguliert, und dass I1 bei Mäusen den arteriellen Blutdruck steuert. In einem nächsten Schritt untersuchten wir die Rolle von PKD1 in der Regulierung von NCC. Immunohistochemische Analysen bestätigten, dass PKD1 im DCT von Mäusen und Ratten stark exprimiert ist. In adrenalektomierten Ratten erhöhte eine einzelne Injektion von Aldosteron (<2h) rasch sowohl die Gesamtexpression wie auch die Phosphorylierung von PKD1 im DCT. Die Induktion von PKD1 ging mit einer verstärkten Phosphorylierung von NCC einher. Umgekehrt zeigten Aldosteronsynthase‐defiziente Mäuse, die keine endogene Aldosteron‐Produktion besitzen, eine Verminderung der PKD1‐mRNA‐Konzentration und ‐Proteinexpression sowie eine Verminderung der Phosphorylierung von PKD1 und NCC. Zur weiteren Untersuchung der Rolle von PKD1 im DCT in vivo generierten wir Mäuse mit einer spezifischen Deletion von PKD1 im frühen DCT (PKD1‐KO) durch die Kreuzung von PKD1flox/flox‐Mäusen mit Mäusen, die cre unter der Kontrolle des DCT‐spezifischen Parvalbumin‐Promotors exprimieren (PV‐cre‐Mäuse). PKD1‐KO Mäuse zeigten eine geringere NCC‐ Phosphorylierung ohne dass dabei die Gesamtexpression von NCC verändert war. Bezüglich der renalen Ionenausscheidung sowie der Plasmaionenkonzentration unterschieden sich die PKD1‐KO Tiere nicht von ihren Kontroll‐Geschwistern. Allerdings war die renale Aldosteron‐Ausscheidung in PKD1‐KO‐Mäusen erhöht, was auf einen milden renalen Salzverlust hinweist. In Übereinstimmung mit den erhöhten Aldosteronwerten wiesen die PKD1‐KO Mäuse eine erhöhte Expression des epithelialen Natrium‐Kanals, ENaC, im Sammelrohrsystem auf. Unter salzarmer Diät war der Blutdruck der PKD1‐KO‐Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren verringert. Daraus schlossen wir, dass PKD1 ein weiteres DCT‐angereichertes Genprodukt ist, das sowohl die NCC‐Phosphorylierung als auch den arteriellen Blutdruck steuert. Interessanterweise sind Veränderungen in der NCC‐Aktivität und damit des DCT‐ Natriumtransportes häufig mit einer ausgeprägten strukturellen Veränderung des DCT‐Epithels assoziiert. So geht ein verstärkter Salztransport im DCT beispielsweise mit eine Hypertrophie und Hyperplasie der DCT‐Zellen einher, während bei einem verminderten Salztransport das Segment atrophiert oder sogar eine Apoptose der DCT‐Zellen auftreten kann. Um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen für diese Plastizität des DCTs bei Mäusen zu identifizieren, stimulierten bzw. inhibierten wir das DCT‐Zellwachstum durch verschiedene pharmakologische Interventionen (d.h. Furosemid‐ und Thiazid‐Behandlung). Anschließend verwendeten wir die Fluoreszenz‐aktivierte Sortierung‐mehrzelliger Objekte (complex object and parametric analysis and sorting ‐ COPAS) um grün fluoreszierende DCTs zu isolieren welche dann für die differentielle Microarray‐Analyse aufbereitet wurden. Mehr als 500 unterschiedlich regulierte Gene wurden nach vierstündiger Furosemid‐ oder Thiazid‐Behandlung gefunden. Vier potenziell relevante Gene wurden ausgewählt und ihre differentielle Regulation mittels quantitativer RT‐PCR bestätigt: transientes Rezeptor‐ Potential‐Melastatin 6‐Kanal (TRPM6), Salz‐induzierbare Kinase 1 (SIK1), Kationentransport‐Regler (Chac1) und Transkriptions‐Faktor Prox1. Die spezifischen Rollen dieser unterschiedlich regulierten Gene für DCT‐Wachstum und ‐Funktion muss in weiteren Experimenten untersucht werden. Mangels eines geeigneten DCT‐Zellmodells war es ein weiteres Ziel, ein DCT‐Zellkultursystem zu entwickeln, in dem die Funktion von Zielgenen ex vivo analysiert werden kann. Wir setzten die COPAS‐Technik ein, um in großem Maßstab DCTs aus transgenen Mäusen, die eGFP spezifisch im DCT1 exprimieren (PV‐eGFP‐Mäuse), zu isolieren. Die isolierten DCTs wurden in Zellkulturschalen und auf semipermeablen Filter sortiert, um ein Wachstum unter Zellkultur‐Bedingungen zu ermöglichen. Nach 10 Tagen in Kultur bildeten die DCT‐Zellen ein dichtes, polarisiertes Epithel mit einem beträchtlichen transepithelialen Widerstand. qRT‐PCR und Immunozytochemie bestätigten, dass die herangewachsenen Zellen viele DCT‐Zelleigenschaften einschließlich der Expression von NCC und WNK1 beibehielten. Allerdings war die NCC‐Expression im Vergleich zu in vivo‐Bedingungen so stark reduziert, dass biochemische Analysen nicht mehr möglich waren. Eine weiterführende Optimierung der Zellkultur‐Bedingungen ist notwendig um ein zuverlässiges, DCT‐spezifisches in vitro System zu generieren. Zusammenfassend unterstützen unsere Daten die Hypothese, dass der DCT über ein spezifisches Repertoire an Proteinen verfügt, die seine Funktion gezielt regulieren. Für zwei dieser Proteine (I1 und PKD1), konnte gezeigt werden, dass sie in die Regulierung der Funktion von NCC und des Blutdruck involviert sind. Weiter wurde die Bedeutung diese Proteine in entsprechenden Gen‐veränderten Mausmodellen studiert. Bezüglich der Regulierung der strukturellen Plastizität des DCTs konnten mehrere neue Kandidatengene, identifiziert werden. Weiterhin wurde ein Protokoll zur Gewinnung primärer DCT‐Zellkulturen aus Wildtyp‐ und transgenen Mäusen etabliert, das die Testung der funktionellen Bedeutung von Zielgenen ex vivo ermöglicht. Diese Arbeit liefert somit neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der NCC‐Regulierung und der Kontrolle des Blutdrucks. Darüber hinaus stellt sie neue Daten und Werkzeuge vor, welche für die zukünftige Erforschung der Funktion des DCT relevant sind.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Loffing Johannes, Wagner Carsten
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2013
Deposited On:09 Apr 2019 13:13
Last Modified:07 Apr 2020 07:17
Number of Pages:100
OA Status:Closed
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