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High density lipoprotein from patients with coronary disease exerts altered endothelial effects : role of proteome remodeling


Riwanto, Meliana. High density lipoprotein from patients with coronary disease exerts altered endothelial effects : role of proteome remodeling. 2013, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Epidemiological studies have strongly suggested that reduced plasma levels of HDL cholesterol are associated with an increased risk of coronary artery disease. Raising HDL Cholesterol is therefore being examined as a potentially important therapeutic strategy. However, recent genetic data and clinical trials have been inconclusive on the beneficial effects of raising HDL cholesterol levels. Clinical trials using the HDL cholesterol raising agents torcetrapib, dalcetrapib and niacin have shown that no significant reduction of cardiovascular events was observed in patients with coronary disease. These recent failures in treatments that raise HDL cholesterol levels have cast doubt on whether HDL plays a truly protective role in cardiovascular disease.
In recent years, various biological functions of HDL have been identified, that may account for the ability of HDL to protect against atherosclerosis. Endothelial dysfunction is suggested to play a critical role in development and progression of atherosclerosis and recent studies have suggested that HDL exerts direct endothelial-protective effects, such as stimulation of endothelial production of the anti-atherogenic molecule nitric oxide, anti-inflammatory, anti-apoptotic, and anti-thrombotic effects. However, accumulating evidence suggests that the vascular effects of HDL may be highly heterogenous and vasoprotective properties of HDL may be impaired in patients with inflammatory or cardiovascular disease. It is therefore essential to elucidate the mechanisms leading to impaired vascular effects of HDL in coronary artery disease and to understand the importance of raising HDL with atheroprotective quality.
The first aim of this thesis was to investigate the effects of HDL isolated from patients with coronary artery disease (CAD) on endothelial function and to characterize the mechanisms leading to impaired vascular effects of HDL in patients with CAD, in particular the effects of HDL on endothelial apoptotic signaling pathways. The second aim of my thesis was to optimize cell-based assays that allow for high-throughput assessment of the endothelial effects of HDL. Finally, in order to elucidate the mechanisms of action of HDL and its altered vascular effects in cardiovascular diseases, there is a need to characterize HDL cargo. The third aim of my thesis was to use targeted proteomics to investigate changes in the protein compositions of HDL that may modulate its function in coronary artery disease.
In order to investigate the effects of HDL on endothelial apoptosis signaling and its alterations in coronary disease, I have isolated HDL from patients with CAD and characterized its mechanisms of action. In contrast to HDL from healthy subjects, HDL isolated from patients with CAD failed to inhibit endothelial cell apoptosis in vitro and in apoE-deficient-mice in vivo. Instead, HDL isolated from these patients stimulated endothelial pro-apoptotic pathways, in particular p38-MAPK-mediated activation of the pro-apoptotic Bcl- 2-protein tBid. This study further suggests that differences in the proteome of HDL from patients with CAD, in particular reduced HDL-associated clusterin and increased HDL-associated apoC-III, play an important role for altered activation of endothelial anti- and pro-apoptotic signaling pathways.
I have optimized cell-based assays for the assessment of HDL function, in particular the capacity of HDL to inhibit TNF-α-induced VCAM-1 expression, to reduce active caspase-3 activation and to stimulate nitric oxide production. These assays were used to evaluate the impact of cholesteryl ester transfer protein (CETP) inhibitor treatment on the endothelial effects of HDL. Treatment with dalcetrapib failed to restore HDL functions to the level of healthy subjects, which may explain, at least in part, the lack of benefit on endothelial function seen in the dal-VESSEL trial.
Interestingly, despite the failure of torcetrapib in clinical trial resulting in increased cardiovascular mortality, no impairment in HDL functions was observed following torcetrapib treatment in this study. This finding may explain the lack of improvement in the quality of HDL following torcetrapib treatment, however the adverse effects observed in the clinical trial of torcetrapib were likely caused by off-target side effects, which may have been due to direct deleterious actions of torcetrapib on endothelial function, independent of the HDL cholesterol raising effect.
Last but not least, using quantitative proteomics analysis with selected reaction monitoring (SRM), it was observed that HDL from patients with CAD has significantly altered protein compositions as compared to HDL from healthy subjects, further supporting our earlier observations. Notably, significant differences were observed in the HDL proteome between patients with CAD who died from cardiovascular events versus patients who did not develop any events during the entire follow-up study period. This finding may identify potential markers in determining patients at risk of developing future cardiovascular events. More importantly, some of the proteins identified will allow better understanding of the mechanisms of action of HDL and its alterations in cardiovascular disease. Of note, some of the proteins identified to be differentially regulated are not related to lipoprotein metabolism, indicating that HDL physiology and its pathophysiology in CAD is beyond simply regulation of lipid metabolism but also other metabolic processes such as innate immunity and regulation of oxidative stress. In epidemiologischen Studien waren verringerte Plasmaspiegel des HDL-Cholesterols mit einem erhöhten Risiko für koronare Herzerkrankung (KHK) assoziiert. Daher wird derzeit untersucht, ob die Steigerung der HDL-Cholesterolspiegels im Blut eine erfolgreiche therapeutische Strategie bei KHK darstellt. Jedoch lieferten aktuelle genetische Untersuchungen und klinische Studien widersprüchliche Daten zum Effekt einer Steigerung der HDL-Spiegel. Klinische Studien, bei denen die HDL-steigernden Substanzen Torcetrapib, Dalcetrapib und Niacin eingesetzt wurden, konnte bei Patienten mit KHK keine signifikante Verringerung kardiovaskulärer Ereignisse beobachtet werden. Diese Studienergebnisse führten zu Zweifeln an der postulierten protektiven Wirkung einer HDL-Steigerung bei KHK.
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene biologische Funktionen des HDL-Cholesterols identifiziert, welche dessen atheroprotektive Wirksamkeit beeinflussen könnten. Besonders der endothelialen Dysfunktion wird eine wichtige Rolle in der Entstehung und Entwicklung der Atherosklerose zugeschrieben und von aktuellen Studienergebnissen wurde eine endothel-protektive Wirkung des HDL-Cholesterols abgeleitet, beispielsweise die Produktion des anti-atherogenen Stickstoffmonoxids durch Endothelzellen, sowie weitere inflammationshemmende, überlebensfördernde und thrombosehemmende Eigenschaften. Allerdings deuten die Ergebnisse mehrerer Studien darauf hin dass die Eigenschaften des isolierten HDLs sehr heterogen und abhängig vom Gesundheitszustand des Spenders sind. Die gefässprotektiven Eigenschaften des HDL könnten bei Patienten mit inflammatorischen oder kardiovaskulären Erkrankungen verringert sein. Es ist daher wichtig, die Mechanismen zu verstehen, die zu einer Einschränkung der gefässschützenden Eigenschaften des HDL bei Patienten mit KHK führen und die Bedeutung einer Erhöhung speziell von HDL mit gefässschützenden Eigenschaften zu verstehen.
Das Ziel dieser Dissertation war daher zunächst, die Effekte von HDL von Patienten mit KHK auf die Endothelfunktion zu untersuchen und die Mechanismen zu charakterisieren, welche die vaskulären Eigenschaften des HDLs bei Patienten mit KHK einschränken, speziell die Effekte des HDLs auf apoptose- relevante Signalwege in Endothelzellen. Das zweite Ziel war, zellbasierte Tests für die Hochdurchsatz- Analyse der endothelialen Effekte des HDLs zu optimieren. Weiterhin war es wichtig, die Proteinbeladung des HDLs zu charakterisieren, um die Wirkmechanismen des HDLs und seine veränderten vaskulären Effekte bei kardiovaskulären Erkrankungen besser zu verstehen. Das dritte Ziel der Dissertation war daher, die gezielte Proteomanalyse einzusetzen, um Veränderungen in der Proteinzusammensetzung des HDLs zu identifizieren, die dessen Funktion bei Patienten mit KHK verändern könnten.
Für die Charakterisierung der molekularen Effekte des HDL auf zelluläre Signalwege zur Steuerung der endothelialen Apoptose und deren Änderung bei KHK habe ich zunächst HDL von Patienten mit KHK sowie von gesunden Probanden isoliert und dessen molekulare Effekte untersucht. Im Vergleich zu gesundem HDL war HDL von Patienten mit KHK nicht in der Lage, die Apoptose von Endothelzellen in vitro und in vivo in ApolipoproteinE-defizienten Mäusen zu verhindern. Stattdessen stimulierte das HDL von KHK-Patienten pro-apoptotische Signalwege in Endothelzellen, wie die Aktivierung des pro-apoptotischen Proteins tBid, eines Mitglieds der Bcl-2-Proteinfamilie, durch die Kinase p38-MAPK. Die Studienergebnisse deuten weiterhin darauf hin, dass Unterschiede im Proteom des HDL von KHK-Patienten, einschliesslich einer Verringerung von HDL-assoziiertem Clusterin und einer Erhöhung von HDL-assoziiertem ApoC-III, eine wichtige Rolle bei der Modulierung von endothelialen pro- und anti-apoptotischen Signalwegen spielen.
Ich habe zellbasierte Untersuchungsmethoden der HDL-Funktion für Hochdurchsatzanalysen optimiert, speziell die Bestimmung der Fähigkeit des HDLs, die TNF-α-induzierte Hochregulation der VCAM-1- Expression und die Aktivierung der Caspase-3 zu verringern, sowie die Produktion von Stickstoffmonoxid zu induzieren. Diese Methoden wurden verwendet, um den Einfluss von Inhibitoren des Cholesterylester- Transferproteins (CETP) auf die endothelialen Effekte des HDLs zu testen. Die Behandlung mit Dalcetrapib bei KHK-Patienten konnte die HDL-Funktion nicht auf die Werte des HDLs von gesunden Probanden anheben. Dies könnte, zummindest teilweise, erklären warum in der “Dal-VESSEL”-Studie keine Verbesserung der Endothelfunktion beobachtet werden konnte. Interessant ist, dass wir trotz des Versagens von Torcetrapib in klinischen Studien, bei denen eine erhöhte Mortalität beschrieben wurde, keine Verschlechterung der HDL-Funktion beobachteten. Dies mag erklären, warum keine Verbesserung der HDL- Qualität durch Torcetrapib erreicht werden konnte. Die beobachteten unerwünschten Ereignisse, die in der Torcetrapib-Studie beobachtet wurden, wurden möglicherweise durch Nebenwirkungen des Medikaments hervorgerufen, beispielsweise durch direkte, HDL-unabhängige Effekte des Torcetrapibs auf die Endothelfunktion.
Im letzten Teil der Dissertation konnte mithilfe der quantitativen Proteomanalyse, bei der die Technik „selected reaction monitoring (SRM)“ eingesetzt wurde, gefunden werden, dass sich die Proteinzusammensetzung des HDLs von Patienten mit KHK signifikant vom HDL gesunder Probanden unterscheidet. Dies unterstützt zusätzlich unsere früheren Beobachtungen. Von besonderer Bedeutung ist die Identifizierung von Unterschieden in der HDL-Zusammensetzung von Patienten mit KHK, die später an einem kardiovaskulären Ereignis verstarben, im Vergleich zu Patienten, welche während des follow-up- Zeitraums kein Ereignis erlitten hatten. Diese Beobachtung könnte in der Zukunft zur Identifizierung von Markern dienen, um Patienten zu erkennen, die ein erhöhtes Risiko haben, ein kardiovaskuläres Ereignis zu erleiden. Weiterhin ermöglichen einige der identifizierten Proteine ein besseres Verständnis der Wirkmechanismen des HDLs und seiner Veränderungen bei kardiovaskulären Erkrankungen. In diesem Zusammenhang ist von besonderem Interesse, dass für einige der verändert vorhandenen Proteine bislang keine Rolle im Lipoproteinmetabolismus bekannt war. Dies legt den Schluss nahe, dass die physiologische Rolle des HDL, sowie seine pathophysiologischen Veränderungen bei KHK , sich über die einfache Regulation des Lipidmetabolismus erstreckt und weitere Prozesse, beispielsweise die unspezifische Immunabwehr und die Regulation des oxidativen Stresses beeinflusst.

Abstract

Epidemiological studies have strongly suggested that reduced plasma levels of HDL cholesterol are associated with an increased risk of coronary artery disease. Raising HDL Cholesterol is therefore being examined as a potentially important therapeutic strategy. However, recent genetic data and clinical trials have been inconclusive on the beneficial effects of raising HDL cholesterol levels. Clinical trials using the HDL cholesterol raising agents torcetrapib, dalcetrapib and niacin have shown that no significant reduction of cardiovascular events was observed in patients with coronary disease. These recent failures in treatments that raise HDL cholesterol levels have cast doubt on whether HDL plays a truly protective role in cardiovascular disease.
In recent years, various biological functions of HDL have been identified, that may account for the ability of HDL to protect against atherosclerosis. Endothelial dysfunction is suggested to play a critical role in development and progression of atherosclerosis and recent studies have suggested that HDL exerts direct endothelial-protective effects, such as stimulation of endothelial production of the anti-atherogenic molecule nitric oxide, anti-inflammatory, anti-apoptotic, and anti-thrombotic effects. However, accumulating evidence suggests that the vascular effects of HDL may be highly heterogenous and vasoprotective properties of HDL may be impaired in patients with inflammatory or cardiovascular disease. It is therefore essential to elucidate the mechanisms leading to impaired vascular effects of HDL in coronary artery disease and to understand the importance of raising HDL with atheroprotective quality.
The first aim of this thesis was to investigate the effects of HDL isolated from patients with coronary artery disease (CAD) on endothelial function and to characterize the mechanisms leading to impaired vascular effects of HDL in patients with CAD, in particular the effects of HDL on endothelial apoptotic signaling pathways. The second aim of my thesis was to optimize cell-based assays that allow for high-throughput assessment of the endothelial effects of HDL. Finally, in order to elucidate the mechanisms of action of HDL and its altered vascular effects in cardiovascular diseases, there is a need to characterize HDL cargo. The third aim of my thesis was to use targeted proteomics to investigate changes in the protein compositions of HDL that may modulate its function in coronary artery disease.
In order to investigate the effects of HDL on endothelial apoptosis signaling and its alterations in coronary disease, I have isolated HDL from patients with CAD and characterized its mechanisms of action. In contrast to HDL from healthy subjects, HDL isolated from patients with CAD failed to inhibit endothelial cell apoptosis in vitro and in apoE-deficient-mice in vivo. Instead, HDL isolated from these patients stimulated endothelial pro-apoptotic pathways, in particular p38-MAPK-mediated activation of the pro-apoptotic Bcl- 2-protein tBid. This study further suggests that differences in the proteome of HDL from patients with CAD, in particular reduced HDL-associated clusterin and increased HDL-associated apoC-III, play an important role for altered activation of endothelial anti- and pro-apoptotic signaling pathways.
I have optimized cell-based assays for the assessment of HDL function, in particular the capacity of HDL to inhibit TNF-α-induced VCAM-1 expression, to reduce active caspase-3 activation and to stimulate nitric oxide production. These assays were used to evaluate the impact of cholesteryl ester transfer protein (CETP) inhibitor treatment on the endothelial effects of HDL. Treatment with dalcetrapib failed to restore HDL functions to the level of healthy subjects, which may explain, at least in part, the lack of benefit on endothelial function seen in the dal-VESSEL trial.
Interestingly, despite the failure of torcetrapib in clinical trial resulting in increased cardiovascular mortality, no impairment in HDL functions was observed following torcetrapib treatment in this study. This finding may explain the lack of improvement in the quality of HDL following torcetrapib treatment, however the adverse effects observed in the clinical trial of torcetrapib were likely caused by off-target side effects, which may have been due to direct deleterious actions of torcetrapib on endothelial function, independent of the HDL cholesterol raising effect.
Last but not least, using quantitative proteomics analysis with selected reaction monitoring (SRM), it was observed that HDL from patients with CAD has significantly altered protein compositions as compared to HDL from healthy subjects, further supporting our earlier observations. Notably, significant differences were observed in the HDL proteome between patients with CAD who died from cardiovascular events versus patients who did not develop any events during the entire follow-up study period. This finding may identify potential markers in determining patients at risk of developing future cardiovascular events. More importantly, some of the proteins identified will allow better understanding of the mechanisms of action of HDL and its alterations in cardiovascular disease. Of note, some of the proteins identified to be differentially regulated are not related to lipoprotein metabolism, indicating that HDL physiology and its pathophysiology in CAD is beyond simply regulation of lipid metabolism but also other metabolic processes such as innate immunity and regulation of oxidative stress. In epidemiologischen Studien waren verringerte Plasmaspiegel des HDL-Cholesterols mit einem erhöhten Risiko für koronare Herzerkrankung (KHK) assoziiert. Daher wird derzeit untersucht, ob die Steigerung der HDL-Cholesterolspiegels im Blut eine erfolgreiche therapeutische Strategie bei KHK darstellt. Jedoch lieferten aktuelle genetische Untersuchungen und klinische Studien widersprüchliche Daten zum Effekt einer Steigerung der HDL-Spiegel. Klinische Studien, bei denen die HDL-steigernden Substanzen Torcetrapib, Dalcetrapib und Niacin eingesetzt wurden, konnte bei Patienten mit KHK keine signifikante Verringerung kardiovaskulärer Ereignisse beobachtet werden. Diese Studienergebnisse führten zu Zweifeln an der postulierten protektiven Wirkung einer HDL-Steigerung bei KHK.
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene biologische Funktionen des HDL-Cholesterols identifiziert, welche dessen atheroprotektive Wirksamkeit beeinflussen könnten. Besonders der endothelialen Dysfunktion wird eine wichtige Rolle in der Entstehung und Entwicklung der Atherosklerose zugeschrieben und von aktuellen Studienergebnissen wurde eine endothel-protektive Wirkung des HDL-Cholesterols abgeleitet, beispielsweise die Produktion des anti-atherogenen Stickstoffmonoxids durch Endothelzellen, sowie weitere inflammationshemmende, überlebensfördernde und thrombosehemmende Eigenschaften. Allerdings deuten die Ergebnisse mehrerer Studien darauf hin dass die Eigenschaften des isolierten HDLs sehr heterogen und abhängig vom Gesundheitszustand des Spenders sind. Die gefässprotektiven Eigenschaften des HDL könnten bei Patienten mit inflammatorischen oder kardiovaskulären Erkrankungen verringert sein. Es ist daher wichtig, die Mechanismen zu verstehen, die zu einer Einschränkung der gefässschützenden Eigenschaften des HDL bei Patienten mit KHK führen und die Bedeutung einer Erhöhung speziell von HDL mit gefässschützenden Eigenschaften zu verstehen.
Das Ziel dieser Dissertation war daher zunächst, die Effekte von HDL von Patienten mit KHK auf die Endothelfunktion zu untersuchen und die Mechanismen zu charakterisieren, welche die vaskulären Eigenschaften des HDLs bei Patienten mit KHK einschränken, speziell die Effekte des HDLs auf apoptose- relevante Signalwege in Endothelzellen. Das zweite Ziel war, zellbasierte Tests für die Hochdurchsatz- Analyse der endothelialen Effekte des HDLs zu optimieren. Weiterhin war es wichtig, die Proteinbeladung des HDLs zu charakterisieren, um die Wirkmechanismen des HDLs und seine veränderten vaskulären Effekte bei kardiovaskulären Erkrankungen besser zu verstehen. Das dritte Ziel der Dissertation war daher, die gezielte Proteomanalyse einzusetzen, um Veränderungen in der Proteinzusammensetzung des HDLs zu identifizieren, die dessen Funktion bei Patienten mit KHK verändern könnten.
Für die Charakterisierung der molekularen Effekte des HDL auf zelluläre Signalwege zur Steuerung der endothelialen Apoptose und deren Änderung bei KHK habe ich zunächst HDL von Patienten mit KHK sowie von gesunden Probanden isoliert und dessen molekulare Effekte untersucht. Im Vergleich zu gesundem HDL war HDL von Patienten mit KHK nicht in der Lage, die Apoptose von Endothelzellen in vitro und in vivo in ApolipoproteinE-defizienten Mäusen zu verhindern. Stattdessen stimulierte das HDL von KHK-Patienten pro-apoptotische Signalwege in Endothelzellen, wie die Aktivierung des pro-apoptotischen Proteins tBid, eines Mitglieds der Bcl-2-Proteinfamilie, durch die Kinase p38-MAPK. Die Studienergebnisse deuten weiterhin darauf hin, dass Unterschiede im Proteom des HDL von KHK-Patienten, einschliesslich einer Verringerung von HDL-assoziiertem Clusterin und einer Erhöhung von HDL-assoziiertem ApoC-III, eine wichtige Rolle bei der Modulierung von endothelialen pro- und anti-apoptotischen Signalwegen spielen.
Ich habe zellbasierte Untersuchungsmethoden der HDL-Funktion für Hochdurchsatzanalysen optimiert, speziell die Bestimmung der Fähigkeit des HDLs, die TNF-α-induzierte Hochregulation der VCAM-1- Expression und die Aktivierung der Caspase-3 zu verringern, sowie die Produktion von Stickstoffmonoxid zu induzieren. Diese Methoden wurden verwendet, um den Einfluss von Inhibitoren des Cholesterylester- Transferproteins (CETP) auf die endothelialen Effekte des HDLs zu testen. Die Behandlung mit Dalcetrapib bei KHK-Patienten konnte die HDL-Funktion nicht auf die Werte des HDLs von gesunden Probanden anheben. Dies könnte, zummindest teilweise, erklären warum in der “Dal-VESSEL”-Studie keine Verbesserung der Endothelfunktion beobachtet werden konnte. Interessant ist, dass wir trotz des Versagens von Torcetrapib in klinischen Studien, bei denen eine erhöhte Mortalität beschrieben wurde, keine Verschlechterung der HDL-Funktion beobachteten. Dies mag erklären, warum keine Verbesserung der HDL- Qualität durch Torcetrapib erreicht werden konnte. Die beobachteten unerwünschten Ereignisse, die in der Torcetrapib-Studie beobachtet wurden, wurden möglicherweise durch Nebenwirkungen des Medikaments hervorgerufen, beispielsweise durch direkte, HDL-unabhängige Effekte des Torcetrapibs auf die Endothelfunktion.
Im letzten Teil der Dissertation konnte mithilfe der quantitativen Proteomanalyse, bei der die Technik „selected reaction monitoring (SRM)“ eingesetzt wurde, gefunden werden, dass sich die Proteinzusammensetzung des HDLs von Patienten mit KHK signifikant vom HDL gesunder Probanden unterscheidet. Dies unterstützt zusätzlich unsere früheren Beobachtungen. Von besonderer Bedeutung ist die Identifizierung von Unterschieden in der HDL-Zusammensetzung von Patienten mit KHK, die später an einem kardiovaskulären Ereignis verstarben, im Vergleich zu Patienten, welche während des follow-up- Zeitraums kein Ereignis erlitten hatten. Diese Beobachtung könnte in der Zukunft zur Identifizierung von Markern dienen, um Patienten zu erkennen, die ein erhöhtes Risiko haben, ein kardiovaskuläres Ereignis zu erleiden. Weiterhin ermöglichen einige der identifizierten Proteine ein besseres Verständnis der Wirkmechanismen des HDLs und seiner Veränderungen bei kardiovaskulären Erkrankungen. In diesem Zusammenhang ist von besonderem Interesse, dass für einige der verändert vorhandenen Proteine bislang keine Rolle im Lipoproteinmetabolismus bekannt war. Dies legt den Schluss nahe, dass die physiologische Rolle des HDL, sowie seine pathophysiologischen Veränderungen bei KHK , sich über die einfache Regulation des Lipidmetabolismus erstreckt und weitere Prozesse, beispielsweise die unspezifische Immunabwehr und die Regulation des oxidativen Stresses beeinflusst.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Aebersold Rudolf, Landmesser Ulf
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zurich
Date:2013
Deposited On:09 Apr 2019 14:47
Last Modified:07 Apr 2020 07:17
Number of Pages:119
OA Status:Green
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