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Identification of synthetic lethal gene interactions with REV3 in lung cancer cells


Kotov, Ilya. Identification of synthetic lethal gene interactions with REV3 in lung cancer cells. 2013, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Identifizierung von synthetisch-letalen genetischen Interaktionen mit REV3 in Lungenkrebszellen Polymerase ζ (Zeta) ist die einzige bekannte Transläsionspolymerase, deren Knockout embryonale Letalität bei Mäusen bewirkt. Diese Tatsache legt nahe, dass sie, abgesehen von ihrer Funktion in der postreplikativen DNA Reparatur, eine besondere, noch unbekannte Rolle in der Entwicklung von Säugetieren spielt.
Es ist bekannt, dass die Hemmung von REV3, der katalytischen Untereinheit der Transläsionspolymerase ζ, die Resistenzbildung gegen Cisplatin reduziert und die Empfindlichkeit der menschlichen Zellen dagegen erhöht. Neueste Erkenntnisse aus unserem Labor zeigten, dass die Hemmung von REV3 per se das Zellwachstum von Mesotheliom-, Lungenkrebs- und Brustkrebszellen reduziert, während normalen Zellen weniger betroffen sind.
Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, Gene zu identifizieren, deren Hemmung das Wachstum von REV3 -defizitären Krebszellen nicht nur reduzieren sondern vollständig stoppen kann, d.h. synthetisch-letale Interaktionen mit REV3 in menschlichen Lungenkrebszellen zu identifizieren. Dieses wurde getan, um krebsspezifische Änderungen zu erkennen, die für die beobachtete differenzielle Wirkung von REV3 per se verantwortlich sein könnten. Darüber hinaus könnte die Entdeckung solcher Gene die Grundlage für eine neue Kombinationstherapie bieten. Schliesslich erwarteten wir von den Ergebnissen auch neue Einblicke in die zelluläre Funktion von REV3.
Mit einer Gesamtgenom-siRNA-Bibliothek haben wir wiederholt globale Screens durchgeführt, um Ziele zu identifizieren, deren Hemmung vorzugsweise die Lebensfähigkeit von REV3-defizitären A549-Lungenkrebszellen reduziert. Einer der Top-Hits, welcher in unabhängigen Experimenten bestätigt wurde, war RRM1, die grosse Untereinheit der Ribonucleotidreduktase (RNR), eines kritischen Enzyms des de novo-Nukleotidsynthesewegs.
Die Behandlung mit dem RNR-Inhibitor Hydroxurea (HU) erhöhte synergistisch den Anteil der REV3-defizitären Zellen, welche Einzelstrang-DNA (ssDNA) enthalten, was mit Hilfe der Durchflusszytometrie als erhöhte Immunfluoreszenzfärbung von Replikationsprotein A (RPA) erkennbar war. Dieser Anstieg war jedoch nicht von einer Akkumulation des DNA-Schadenmarkers γH2AX begleitet, was darauf hindeutet, dass REV3 nicht nur eine Funktion in der DNA Reparatur sondern auch in der Toleranz gegen Replikationsstress (RS) hat. Weiter beschränkte sich die erhöhte RPA-Färbung auf Zellen in der S-Phase des Zellzyklus was im Einklang mit einer Rolle von REV3 während der DNA Replikation ist. Zusätzlich haben wir festgestellt, dass Gene, welche mit RS assoziiert sind, unter den Top-Hits des Screens signifikant angereichert waren, was die Bedeutung von REV3 für die Replikation unter RS Bedingungen weiter bekräftigt. Zusammengefasst implizieren diese Daten eine neue Funktion von REV3 in der Toleranz von RS, welche sowohl die krebsspezifische Wirkung der REV3-Hemmung auf molekularer Ebene erklären als auch die Unentbehrlichkeit von REV3 während der embryonalen Entwicklung in Säugetieren begründen würde. Identification of Synthetic Lethal Gene Interactions with REV3 in Lung Cancer Cells
Polymerase ζ (zeta) is the only known translesion synthesis polymerase, of which the knockout causes embryonic lethality in mice. This fact suggests that apart from its function in post-replication repair it plays a special, yet to be identified, role in mammalian development.
It is known that inhibition of REV3, the catalytic subunit of the translesion polymerase ζ, reduces the formation of resistance and increases the sensitivity of human cells to cisplatin. Surprisingly, recent findings of our laboratory revealed that inhibition of REV3 per se reduces cell growth of mesothelioma, lung- and breast cancer cells whereas normal cells are less affected.
The purpose of my PhD thesis was to identify genes whose inhibition will not only reduce but completely abolish cancer cell growth in a REV3-deficient background, i.e. to investigate synthetic lethal interactions with REV3 in human lung cancer cells. This was done to identify cancer-specific alterations that might be responsible for the observed differential REV3 per se effect. Additionally, the discovery of such genes could provide a rationale for a new combinational therapy. Finally, these results could also give us insights into the cellular function of REV3.
Using a whole-genome siRNA library we performed sets of global screens to identify targets whose inhibition preferentially affects viability of REV3-deficient A549 cells. The top confirmed hit was RRM1, the large subunit of ribonucleotide reductase (RNR), a critical enzyme of de novo nucleotide synthesis.
Treatment with the RNR-inhibitor hydroxyurea (HU) synergistically increased the fraction of REV3- deficient cells containing single stranded DNA (ssDNA) as indicated by increased staining of replication protein A (RPA). However, this increase was not accompanied by accumulation of the DNA damage marker γH2AX suggesting a role of REV3 in tolerance of replication stress (RS). Consistent with a role of REV3 in DNA replication, increased RPA staining was confined to S-phase cells. Additionally, we found genes related to RS to be significantly enriched among the top hits of the synthetic lethality screen further corroborating the importance of REV3 for replication under conditions of RS. These data outline a novel function of mammalian REV3 that could serve as a molecular basis of the observed REV3 cancer-specific per se effect as well as its indispensability during embryonic development.

Abstract

Identifizierung von synthetisch-letalen genetischen Interaktionen mit REV3 in Lungenkrebszellen Polymerase ζ (Zeta) ist die einzige bekannte Transläsionspolymerase, deren Knockout embryonale Letalität bei Mäusen bewirkt. Diese Tatsache legt nahe, dass sie, abgesehen von ihrer Funktion in der postreplikativen DNA Reparatur, eine besondere, noch unbekannte Rolle in der Entwicklung von Säugetieren spielt.
Es ist bekannt, dass die Hemmung von REV3, der katalytischen Untereinheit der Transläsionspolymerase ζ, die Resistenzbildung gegen Cisplatin reduziert und die Empfindlichkeit der menschlichen Zellen dagegen erhöht. Neueste Erkenntnisse aus unserem Labor zeigten, dass die Hemmung von REV3 per se das Zellwachstum von Mesotheliom-, Lungenkrebs- und Brustkrebszellen reduziert, während normalen Zellen weniger betroffen sind.
Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, Gene zu identifizieren, deren Hemmung das Wachstum von REV3 -defizitären Krebszellen nicht nur reduzieren sondern vollständig stoppen kann, d.h. synthetisch-letale Interaktionen mit REV3 in menschlichen Lungenkrebszellen zu identifizieren. Dieses wurde getan, um krebsspezifische Änderungen zu erkennen, die für die beobachtete differenzielle Wirkung von REV3 per se verantwortlich sein könnten. Darüber hinaus könnte die Entdeckung solcher Gene die Grundlage für eine neue Kombinationstherapie bieten. Schliesslich erwarteten wir von den Ergebnissen auch neue Einblicke in die zelluläre Funktion von REV3.
Mit einer Gesamtgenom-siRNA-Bibliothek haben wir wiederholt globale Screens durchgeführt, um Ziele zu identifizieren, deren Hemmung vorzugsweise die Lebensfähigkeit von REV3-defizitären A549-Lungenkrebszellen reduziert. Einer der Top-Hits, welcher in unabhängigen Experimenten bestätigt wurde, war RRM1, die grosse Untereinheit der Ribonucleotidreduktase (RNR), eines kritischen Enzyms des de novo-Nukleotidsynthesewegs.
Die Behandlung mit dem RNR-Inhibitor Hydroxurea (HU) erhöhte synergistisch den Anteil der REV3-defizitären Zellen, welche Einzelstrang-DNA (ssDNA) enthalten, was mit Hilfe der Durchflusszytometrie als erhöhte Immunfluoreszenzfärbung von Replikationsprotein A (RPA) erkennbar war. Dieser Anstieg war jedoch nicht von einer Akkumulation des DNA-Schadenmarkers γH2AX begleitet, was darauf hindeutet, dass REV3 nicht nur eine Funktion in der DNA Reparatur sondern auch in der Toleranz gegen Replikationsstress (RS) hat. Weiter beschränkte sich die erhöhte RPA-Färbung auf Zellen in der S-Phase des Zellzyklus was im Einklang mit einer Rolle von REV3 während der DNA Replikation ist. Zusätzlich haben wir festgestellt, dass Gene, welche mit RS assoziiert sind, unter den Top-Hits des Screens signifikant angereichert waren, was die Bedeutung von REV3 für die Replikation unter RS Bedingungen weiter bekräftigt. Zusammengefasst implizieren diese Daten eine neue Funktion von REV3 in der Toleranz von RS, welche sowohl die krebsspezifische Wirkung der REV3-Hemmung auf molekularer Ebene erklären als auch die Unentbehrlichkeit von REV3 während der embryonalen Entwicklung in Säugetieren begründen würde. Identification of Synthetic Lethal Gene Interactions with REV3 in Lung Cancer Cells
Polymerase ζ (zeta) is the only known translesion synthesis polymerase, of which the knockout causes embryonic lethality in mice. This fact suggests that apart from its function in post-replication repair it plays a special, yet to be identified, role in mammalian development.
It is known that inhibition of REV3, the catalytic subunit of the translesion polymerase ζ, reduces the formation of resistance and increases the sensitivity of human cells to cisplatin. Surprisingly, recent findings of our laboratory revealed that inhibition of REV3 per se reduces cell growth of mesothelioma, lung- and breast cancer cells whereas normal cells are less affected.
The purpose of my PhD thesis was to identify genes whose inhibition will not only reduce but completely abolish cancer cell growth in a REV3-deficient background, i.e. to investigate synthetic lethal interactions with REV3 in human lung cancer cells. This was done to identify cancer-specific alterations that might be responsible for the observed differential REV3 per se effect. Additionally, the discovery of such genes could provide a rationale for a new combinational therapy. Finally, these results could also give us insights into the cellular function of REV3.
Using a whole-genome siRNA library we performed sets of global screens to identify targets whose inhibition preferentially affects viability of REV3-deficient A549 cells. The top confirmed hit was RRM1, the large subunit of ribonucleotide reductase (RNR), a critical enzyme of de novo nucleotide synthesis.
Treatment with the RNR-inhibitor hydroxyurea (HU) synergistically increased the fraction of REV3- deficient cells containing single stranded DNA (ssDNA) as indicated by increased staining of replication protein A (RPA). However, this increase was not accompanied by accumulation of the DNA damage marker γH2AX suggesting a role of REV3 in tolerance of replication stress (RS). Consistent with a role of REV3 in DNA replication, increased RPA staining was confined to S-phase cells. Additionally, we found genes related to RS to be significantly enriched among the top hits of the synthetic lethality screen further corroborating the importance of REV3 for replication under conditions of RS. These data outline a novel function of mammalian REV3 that could serve as a molecular basis of the observed REV3 cancer-specific per se effect as well as its indispensability during embryonic development.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Lopes Massimo
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2013
Deposited On:10 Apr 2019 15:34
Last Modified:07 Apr 2020 07:17
Number of Pages:107
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod010098745&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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