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Mass spectrometry-based approaches to identify novel interaction partners of the tyrosine phosphatase DEP-1


Walser, Michael Simon. Mass spectrometry-based approaches to identify novel interaction partners of the tyrosine phosphatase DEP-1. 2013, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Eine der wichtigsten post-transkriptionellen Protein-Modifikationen ist die reversible Phosphorylier- ung. Katalysiert durch Kinasen und Phosphatasen spielt die Phosphorylierung bzw. Dephosphorylier- ung von Proteinen eine bedeutende Rolle in der Regulation verschiedenster zellulärer Prozesse, wie z.B. in der Regulation des Zell-Zykluses, bei der Wachstumskontrolle, der Apoptose und in der Steuerung von Signalwegen. Eine abnormale Proteinphosphorylierung kann Ursache vieler verschiedener men- schlicher Krankheiten sein, weshalb ein Verständnis dieser Modifikation von wichtiger Bedeutung ist. Der stark konservierte EGFR/RAS/MAPK Signalweg ist der vermutlich am besten untersuchte Signal- transduktionsweg in der Zellbiologie. Er spielt eine bedeutende Rolle in verschiedensten Vorgängen der Entwicklung sowie bei der Entstehung von Krebs. Seine Aktivität wird durch Proteinphosphorylierung moduliert und durch ein komplexes Netzwerk negativer Regulatoren kontrolliert. Einer dieser Regula- toren ist die Protein Tyrosin Phosphatase DEP-1, welche den EGF Rezeptor und andere Rezeptor Tyro- sin Kinasen dephosphoryliert. DEP-1 gehört somit zu den Tumorsuppressoren und ist in zahlreichen menschlichen Tumoren mutiert, wie z.B. in Schilddrüsen-, Darm-, Lungen-, Prostata- und Brustkrebs. Das Ziel dieser Arbeit war, neue Interaktionspartner von DEP-1 im Nematoden C. elegans zu finden. Hierzu reinigte ich verschieden Varianten von markiertem DEP-1 aus C. elegans oder E. coli auf, und identifizierte mittels Massenspektrometrie die Proteine, welche an DEP-1 binden. Dabei entdeckte ich die β-Integrin Untereinheit PAT-3 als neues Substrat von DEP-1. Integrine sind heterodimere Membran- proteine bestehend aus nicht-kovalent verbundenen α und β Untereinheiten, welche unter anderem für die Interaktion von Zellen mit der extrazellulären Matrix sowie für die Aktivierung zahlreicher Signal- wege bedeutsam sind. Sie spielen eine Schlüsselrolle während der Entwicklung, der Immunabwehr, Blut- stillung und der Krebsentstehung, und können somit Ursache vieler menschlicher Krankheiten sein. Anhand verschiedener biochemischer Experimente konnte ich zeigen dass DEP-1 ein konserviertes NPxY Motiv von PAT-3 dephosphoryliert. DEP-1 hat somit eine regulatorische Rolle in der Integrin Aktivierung. Ausserdem untersuchte ich die Interaktion von DEP-1 und PAT-3 in vivo während der Entwicklung der Vulva von C. elegans. Die Vulva ist ein 22-zelliges Organ, durch das der Hermaphrodit seine Eier ablegt. Sie wird von drei Vulvavorläuferzellen gebildet, deren Differenzierungen durch ein Zusammenspiel vom EGFR/RAS/MAPK, DELTA/NOTCH sowie dem WNT Signalweg gesteuert werden. Meine genetischen Experimente zeigten, dass DEP-1 das NPxY Motiv von PAT-3 dephosphoryliert, um die Integrine zu ak- tivieren. Als Folge davon inhibieren aktivierte Integrine den RAS/MAPK Signalweg in den sekundären Vulvavorläuferzellen. Diese Ergebnisse zeigen eine bisher unbekannte Rolle von DEP-1 und den Integrinen in der Regulation des EGFR/RAS/MAPK Signalwegs, und tragen zu einem besseren Verständnis der Funktion und Regu- lierung der Integrine in vivo bei.
Reversible protein phosphorylation is one of the most important and well-studied post-translational modifications. Catalyzed by protein kinases and protein phosphatases, phosphorylation and dephos- phorylation play a critical role in the regulation of many cellular processes, such as cell cycle, cell growth, apoptosis and signal transduction pathways. Abnormal protein phosphorylation can be a cause of human diseases, for which reason an understanding of this modification is of major importance. The highly conserved EGFR/RAS/MAPK signaling pathway is probably the best characterized signal transduction pathway in cell biology and plays a crucial role in many developmental processes and can- cer formation. Its activity is regulated through protein phosphorylation and controlled by a broad nega- tive regulatory network that attenuates the different components of the EGFR/RAS/MAPK pathway. A member of this network is the density enhanced phosphatase DEP-1, which belongs to the receptor protein tyrosine phosphatases. It inhibits EGFR/RAS/MAPK signaling through dephosphorylation of the EGF receptor and thereby acts as a tumor suppressor. It has been found that DEP-1 is frequently de- leted and mutated in various human cancers such as thyroid, colon, lung, pancreatic, and breast cancer. In order to identify novel physiological substrates of DEP-1 in the nematode C. elegans, I performed affinity purifications of differently tagged versions of DEP-1 that were expressed in C. elegans or E. coli. Proteins that bound to DEP-1 were then identified by mass spectrometry. Thereby, the β-integrin subunit PAT-3 was found as a novel substrate of DEP-1. Integrins are non-covalently associated α/β heterodimers that mediate cell adhesions, make transmembrane connections to the cytoskeleton and activate many intracellular signaling pathways. Playing key roles in development, immune response, hemostasis and cancer formation, Integrins are at the heart of many human diseases. By performing several biochemical experiments, I could show that DEP-1 binds to the evolutionary conserved NPXY motif of the PAT-3 cytoplasmic tail, the phosphorylation of which plays a regulatory role in integrin activation. Furthermore, I investigated the interaction of DEP-1 and PAT-3 in vivo during development of the C. elegans hermaphrodite vulva. This simple egg-laying organ is formed by 22 cells and originates from three vulval precursor cells (VPCs), whose cell-fates are determined by the interplay of the EGFR/RAS/ MAPK, DELTA/NOTCH, and WNT signaling pathways. My genetic experiments could show that DEP-1 dephosphorylates the NPXY motif of PAT-3 to promote its activation. As a consequence, activated integrins inhibit the RAS/MAPK signaling pathway in the secondary VPCs. Together, my results demonstrate a novel role of DEP-1 and the integrins during vulval development and give further insights into integrin regulation in vivo.

Abstract

Eine der wichtigsten post-transkriptionellen Protein-Modifikationen ist die reversible Phosphorylier- ung. Katalysiert durch Kinasen und Phosphatasen spielt die Phosphorylierung bzw. Dephosphorylier- ung von Proteinen eine bedeutende Rolle in der Regulation verschiedenster zellulärer Prozesse, wie z.B. in der Regulation des Zell-Zykluses, bei der Wachstumskontrolle, der Apoptose und in der Steuerung von Signalwegen. Eine abnormale Proteinphosphorylierung kann Ursache vieler verschiedener men- schlicher Krankheiten sein, weshalb ein Verständnis dieser Modifikation von wichtiger Bedeutung ist. Der stark konservierte EGFR/RAS/MAPK Signalweg ist der vermutlich am besten untersuchte Signal- transduktionsweg in der Zellbiologie. Er spielt eine bedeutende Rolle in verschiedensten Vorgängen der Entwicklung sowie bei der Entstehung von Krebs. Seine Aktivität wird durch Proteinphosphorylierung moduliert und durch ein komplexes Netzwerk negativer Regulatoren kontrolliert. Einer dieser Regula- toren ist die Protein Tyrosin Phosphatase DEP-1, welche den EGF Rezeptor und andere Rezeptor Tyro- sin Kinasen dephosphoryliert. DEP-1 gehört somit zu den Tumorsuppressoren und ist in zahlreichen menschlichen Tumoren mutiert, wie z.B. in Schilddrüsen-, Darm-, Lungen-, Prostata- und Brustkrebs. Das Ziel dieser Arbeit war, neue Interaktionspartner von DEP-1 im Nematoden C. elegans zu finden. Hierzu reinigte ich verschieden Varianten von markiertem DEP-1 aus C. elegans oder E. coli auf, und identifizierte mittels Massenspektrometrie die Proteine, welche an DEP-1 binden. Dabei entdeckte ich die β-Integrin Untereinheit PAT-3 als neues Substrat von DEP-1. Integrine sind heterodimere Membran- proteine bestehend aus nicht-kovalent verbundenen α und β Untereinheiten, welche unter anderem für die Interaktion von Zellen mit der extrazellulären Matrix sowie für die Aktivierung zahlreicher Signal- wege bedeutsam sind. Sie spielen eine Schlüsselrolle während der Entwicklung, der Immunabwehr, Blut- stillung und der Krebsentstehung, und können somit Ursache vieler menschlicher Krankheiten sein. Anhand verschiedener biochemischer Experimente konnte ich zeigen dass DEP-1 ein konserviertes NPxY Motiv von PAT-3 dephosphoryliert. DEP-1 hat somit eine regulatorische Rolle in der Integrin Aktivierung. Ausserdem untersuchte ich die Interaktion von DEP-1 und PAT-3 in vivo während der Entwicklung der Vulva von C. elegans. Die Vulva ist ein 22-zelliges Organ, durch das der Hermaphrodit seine Eier ablegt. Sie wird von drei Vulvavorläuferzellen gebildet, deren Differenzierungen durch ein Zusammenspiel vom EGFR/RAS/MAPK, DELTA/NOTCH sowie dem WNT Signalweg gesteuert werden. Meine genetischen Experimente zeigten, dass DEP-1 das NPxY Motiv von PAT-3 dephosphoryliert, um die Integrine zu ak- tivieren. Als Folge davon inhibieren aktivierte Integrine den RAS/MAPK Signalweg in den sekundären Vulvavorläuferzellen. Diese Ergebnisse zeigen eine bisher unbekannte Rolle von DEP-1 und den Integrinen in der Regulation des EGFR/RAS/MAPK Signalwegs, und tragen zu einem besseren Verständnis der Funktion und Regu- lierung der Integrine in vivo bei.
Reversible protein phosphorylation is one of the most important and well-studied post-translational modifications. Catalyzed by protein kinases and protein phosphatases, phosphorylation and dephos- phorylation play a critical role in the regulation of many cellular processes, such as cell cycle, cell growth, apoptosis and signal transduction pathways. Abnormal protein phosphorylation can be a cause of human diseases, for which reason an understanding of this modification is of major importance. The highly conserved EGFR/RAS/MAPK signaling pathway is probably the best characterized signal transduction pathway in cell biology and plays a crucial role in many developmental processes and can- cer formation. Its activity is regulated through protein phosphorylation and controlled by a broad nega- tive regulatory network that attenuates the different components of the EGFR/RAS/MAPK pathway. A member of this network is the density enhanced phosphatase DEP-1, which belongs to the receptor protein tyrosine phosphatases. It inhibits EGFR/RAS/MAPK signaling through dephosphorylation of the EGF receptor and thereby acts as a tumor suppressor. It has been found that DEP-1 is frequently de- leted and mutated in various human cancers such as thyroid, colon, lung, pancreatic, and breast cancer. In order to identify novel physiological substrates of DEP-1 in the nematode C. elegans, I performed affinity purifications of differently tagged versions of DEP-1 that were expressed in C. elegans or E. coli. Proteins that bound to DEP-1 were then identified by mass spectrometry. Thereby, the β-integrin subunit PAT-3 was found as a novel substrate of DEP-1. Integrins are non-covalently associated α/β heterodimers that mediate cell adhesions, make transmembrane connections to the cytoskeleton and activate many intracellular signaling pathways. Playing key roles in development, immune response, hemostasis and cancer formation, Integrins are at the heart of many human diseases. By performing several biochemical experiments, I could show that DEP-1 binds to the evolutionary conserved NPXY motif of the PAT-3 cytoplasmic tail, the phosphorylation of which plays a regulatory role in integrin activation. Furthermore, I investigated the interaction of DEP-1 and PAT-3 in vivo during development of the C. elegans hermaphrodite vulva. This simple egg-laying organ is formed by 22 cells and originates from three vulval precursor cells (VPCs), whose cell-fates are determined by the interplay of the EGFR/RAS/ MAPK, DELTA/NOTCH, and WNT signaling pathways. My genetic experiments could show that DEP-1 dephosphorylates the NPXY motif of PAT-3 to promote its activation. As a consequence, activated integrins inhibit the RAS/MAPK signaling pathway in the secondary VPCs. Together, my results demonstrate a novel role of DEP-1 and the integrins during vulval development and give further insights into integrin regulation in vivo.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hajnal Alex
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2013
Deposited On:10 Apr 2019 15:38
Last Modified:15 Apr 2021 15:01
Number of Pages:159
OA Status:Green

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