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Congenital and ethanol-induced disorders of N-linked protein glycosylation


Welti, Michael Andreas. Congenital and ethanol-induced disorders of N-linked protein glycosylation. 2013, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Die Glykosylierung von Proteinen ist eine essentielle Proteinmodifikation, die in allen Domänen des Lebens vorkommt. Etwa 2% des humanen Genoms kodiert Proteine, die Teil der Glykosylierungsmaschinerie sind, und 50% der humanen Proteine sind glykosyliert. Die N-Glykosylierung von Proteinen beginnt im endoplasmatischen Retikulum, wo zuerst der N-Glykan Precursor schrittweise aufgebaut wird, indem einzelne Zuckerbausteine auf einem membran-gebundenen, reduzierten Polyprenolanker, dem Dolichol-phosphat, zusammengefügt werden. Der angefertigte N- Glykan Precursor wird dann co- oder posttranslational vom Dolichol-phosphat auf spezifische Asparaginseitenketten von Zielproteinen übertragen.
Aufgrund der Abundanz der N-Glykosylierung von menschlichen Proteinen in allen Zelltypen weisen vererbte N-Glykosylierungsdefekte ein multi-systemisches Krankheitsbild auf. Vererbte Glykosylierungsdefekte (CDG) beeinträchtigen meist die pränatale Entwicklung des Menschen. Die häufigsten CDG-Symptome sind Epilepsie, Hypotonie, Hyporeflexie, Strabismus, Retinitis pigmentosa, Polyneuropathie, Myopathie und Hypotrophie/Hypoplasie des Kleinhirns. Die Unterglykosylierung von Serumproteinen, wie z.B. Transferrin, wird als Marker für CDG benutzt. Abhängig vom CDG-Typ unterscheiden sich die N-Glykane auf Transferrin, weshalb verschiedene Formen von Desialotransferrin (CDT) detektiert werden können. Die alkoholische Leberkrankheit (ALD) wird interessanterweise von einem N-Glykosylierungsdefekt begleitet. Neben einem ähnlichen CDT-Bild zeigen gewisse CDG-Typen und ALD auch ein anderes gemeinsames Symptom: die Leberfibrose. Die Leber als primärer Ort des Ethanolabbaus ist besonders den Effekten des Alkoholismus betroffen. Obwohl der Zusammenhang zwischen CDT und ALD schon lange bekannt ist, wurde die Glykosylierungsdefizienz in ALD noch nicht vollständig auf molekularer Ebene charakterisiert.
Die medikamentöse Behandlung von CDG ist sehr beschränkt. Ein Beispiel ist MPI-CDG, in der das Enzym, das für die Konversion von Fruktose-6-phosphat zu Mannose-6-phosphat, defekt ist. Diese Reaktion ist wichtig, um Mannose für die Glykosylierungsreaktionen zur Verfügung zu stellen. Eine einfache Supplementierung der Nahrung mit Mannose ist in diesem Fall genug, um die Krankheitserscheinungen zu mildern.
Im ersten Teil dieser Dissertation untersuchten wir das Potenzial eines cholesterin- senkenden Stoffs, Zaragozic acid A, die N-Glykosylierung in DPM1-CDG zu verbessern. DPM1 ist eine Untereinheit der Dolichol-phosphate-mannose Synthase, die als Komplex Dolichol-phosphate-mannose, einen wichtigen Mannose-donor für die N-Glykosylierung, produziert. Zaragozic acid A inhibiert ein Enzym an einer Verzweigung eines Synthesewegs, über den sowohl die Dolichol- als auch Cholesterinproduktion stattfindet. Bei der genannten Verzweigung geht der metabolische Fluss entweder in Richtung Dolichol- oder Cholesterinsynthese. Mit der Blockade des Enzyms, das die abzweigende Reaktion zur Cholesterinsynthese katalysiert, wurde die N-Glykosylierung verbessert, so dass erhöhtes Dolichol-phosphate und eine verbesserte Verteilung der dolichol- und N- assozierten Oligosaccharide gemessen werden konnte. Ausserdem hatte die auf Normwerte erhöhte Dolichol-phosphat-mannose zur Folge, dass die Verfügbarkeit von GPI-Ankern verbessert wurde. Wir konnten also die reduzierte Aktivität der Dolichol- phosphate-mannose Synthase mittels verbesserter Substratverfügbarkeit kompensieren. Daher stellt Zaragozic acid A ein potenzielles Medikament zur Behandlung von DPM1- CDG dar.
Der zweite Teil der Dissertation fokussiert auf die ethanol-induzierte N- Glykosylierungsdefizienz. Dazu haben wir den Effekt von Ethanol auf die N- Glykosylierung in zwei Leberkrebszelllinien untersucht. Die VA-13 und die HepaRG Zelllinien sind gut dazu geeignet, weil sie im Gegensatz zu anderen kultivierten Leberzellen die Alkoholdehydrogenase und das Zytochrom P450 2E1 exprimieren, was die Metabolisierung von Ethanol ermöglicht. Wir konnten nach der Behandlung mit Ethanol niedrigeres Dolichol-phosphat sowie eine niedrigere Verfügbarkeit des N-Glykan Precursors feststellen. Diese Glykosylierungsstörung wurde von transkriptionalen Veränderungen begleitet. DPM1 war runterreguliert während RPN2 hochreguliert wurde. Diese Veränderungen der Transkription könnten regulatorische Mechanismen darstellen, da die DPM Synthase Aktivität erhöht war, obwohl die DPM1-Untereinheit transkriptional runterreguliert war.
Zusammenfassend haben wir uns mit einem vererbten wie auch einem erworbenen N- Glykosylierungsdefekt befasst. Wie haben einen therapeutischen Ansatz zur Milderung des N-Glykosylierungsdefekts in DPM1-CDG Fibroblasten erfoglsversprechend getestet und den ethanol-induzierten N-Glykosylierungsdefekt in zwei Leberzelllinien charakterisiert. Summary Protein glycosylation is an essential protein modification existing in all domains of life. About 2% of the human genome is involved in the glycosylation machinery and 50% of the human proteins are modified with glycans. In the endoplasmic reticulum, N-linked protein glycosylation begins with the assembly of an oligosaccharide precursor by step- wise transfer of sugar building blocks to a membrane-embedded, reduced polyprenol anchor called dolichol-phosphate. The fully assembled N-linked glycan precursor is then transferred co- or post-translationally to defined asparagine residues of target proteins.

Abstract

Die Glykosylierung von Proteinen ist eine essentielle Proteinmodifikation, die in allen Domänen des Lebens vorkommt. Etwa 2% des humanen Genoms kodiert Proteine, die Teil der Glykosylierungsmaschinerie sind, und 50% der humanen Proteine sind glykosyliert. Die N-Glykosylierung von Proteinen beginnt im endoplasmatischen Retikulum, wo zuerst der N-Glykan Precursor schrittweise aufgebaut wird, indem einzelne Zuckerbausteine auf einem membran-gebundenen, reduzierten Polyprenolanker, dem Dolichol-phosphat, zusammengefügt werden. Der angefertigte N- Glykan Precursor wird dann co- oder posttranslational vom Dolichol-phosphat auf spezifische Asparaginseitenketten von Zielproteinen übertragen.
Aufgrund der Abundanz der N-Glykosylierung von menschlichen Proteinen in allen Zelltypen weisen vererbte N-Glykosylierungsdefekte ein multi-systemisches Krankheitsbild auf. Vererbte Glykosylierungsdefekte (CDG) beeinträchtigen meist die pränatale Entwicklung des Menschen. Die häufigsten CDG-Symptome sind Epilepsie, Hypotonie, Hyporeflexie, Strabismus, Retinitis pigmentosa, Polyneuropathie, Myopathie und Hypotrophie/Hypoplasie des Kleinhirns. Die Unterglykosylierung von Serumproteinen, wie z.B. Transferrin, wird als Marker für CDG benutzt. Abhängig vom CDG-Typ unterscheiden sich die N-Glykane auf Transferrin, weshalb verschiedene Formen von Desialotransferrin (CDT) detektiert werden können. Die alkoholische Leberkrankheit (ALD) wird interessanterweise von einem N-Glykosylierungsdefekt begleitet. Neben einem ähnlichen CDT-Bild zeigen gewisse CDG-Typen und ALD auch ein anderes gemeinsames Symptom: die Leberfibrose. Die Leber als primärer Ort des Ethanolabbaus ist besonders den Effekten des Alkoholismus betroffen. Obwohl der Zusammenhang zwischen CDT und ALD schon lange bekannt ist, wurde die Glykosylierungsdefizienz in ALD noch nicht vollständig auf molekularer Ebene charakterisiert.
Die medikamentöse Behandlung von CDG ist sehr beschränkt. Ein Beispiel ist MPI-CDG, in der das Enzym, das für die Konversion von Fruktose-6-phosphat zu Mannose-6-phosphat, defekt ist. Diese Reaktion ist wichtig, um Mannose für die Glykosylierungsreaktionen zur Verfügung zu stellen. Eine einfache Supplementierung der Nahrung mit Mannose ist in diesem Fall genug, um die Krankheitserscheinungen zu mildern.
Im ersten Teil dieser Dissertation untersuchten wir das Potenzial eines cholesterin- senkenden Stoffs, Zaragozic acid A, die N-Glykosylierung in DPM1-CDG zu verbessern. DPM1 ist eine Untereinheit der Dolichol-phosphate-mannose Synthase, die als Komplex Dolichol-phosphate-mannose, einen wichtigen Mannose-donor für die N-Glykosylierung, produziert. Zaragozic acid A inhibiert ein Enzym an einer Verzweigung eines Synthesewegs, über den sowohl die Dolichol- als auch Cholesterinproduktion stattfindet. Bei der genannten Verzweigung geht der metabolische Fluss entweder in Richtung Dolichol- oder Cholesterinsynthese. Mit der Blockade des Enzyms, das die abzweigende Reaktion zur Cholesterinsynthese katalysiert, wurde die N-Glykosylierung verbessert, so dass erhöhtes Dolichol-phosphate und eine verbesserte Verteilung der dolichol- und N- assozierten Oligosaccharide gemessen werden konnte. Ausserdem hatte die auf Normwerte erhöhte Dolichol-phosphat-mannose zur Folge, dass die Verfügbarkeit von GPI-Ankern verbessert wurde. Wir konnten also die reduzierte Aktivität der Dolichol- phosphate-mannose Synthase mittels verbesserter Substratverfügbarkeit kompensieren. Daher stellt Zaragozic acid A ein potenzielles Medikament zur Behandlung von DPM1- CDG dar.
Der zweite Teil der Dissertation fokussiert auf die ethanol-induzierte N- Glykosylierungsdefizienz. Dazu haben wir den Effekt von Ethanol auf die N- Glykosylierung in zwei Leberkrebszelllinien untersucht. Die VA-13 und die HepaRG Zelllinien sind gut dazu geeignet, weil sie im Gegensatz zu anderen kultivierten Leberzellen die Alkoholdehydrogenase und das Zytochrom P450 2E1 exprimieren, was die Metabolisierung von Ethanol ermöglicht. Wir konnten nach der Behandlung mit Ethanol niedrigeres Dolichol-phosphat sowie eine niedrigere Verfügbarkeit des N-Glykan Precursors feststellen. Diese Glykosylierungsstörung wurde von transkriptionalen Veränderungen begleitet. DPM1 war runterreguliert während RPN2 hochreguliert wurde. Diese Veränderungen der Transkription könnten regulatorische Mechanismen darstellen, da die DPM Synthase Aktivität erhöht war, obwohl die DPM1-Untereinheit transkriptional runterreguliert war.
Zusammenfassend haben wir uns mit einem vererbten wie auch einem erworbenen N- Glykosylierungsdefekt befasst. Wie haben einen therapeutischen Ansatz zur Milderung des N-Glykosylierungsdefekts in DPM1-CDG Fibroblasten erfoglsversprechend getestet und den ethanol-induzierten N-Glykosylierungsdefekt in zwei Leberzelllinien charakterisiert. Summary Protein glycosylation is an essential protein modification existing in all domains of life. About 2% of the human genome is involved in the glycosylation machinery and 50% of the human proteins are modified with glycans. In the endoplasmic reticulum, N-linked protein glycosylation begins with the assembly of an oligosaccharide precursor by step- wise transfer of sugar building blocks to a membrane-embedded, reduced polyprenol anchor called dolichol-phosphate. The fully assembled N-linked glycan precursor is then transferred co- or post-translationally to defined asparagine residues of target proteins.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hennet Thierry
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2013
Deposited On:11 Apr 2019 12:33
Last Modified:28 Oct 2019 08:27
Number of Pages:136
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod010150537&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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