Chromatin-associated protein degradation: influence of p97/VCP on key factors in the DNA damage response

Abstract

DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind lebensbedrohliche Läsionen, die zu Chromosomen-Aberration und folglich zu genomischer Instabilität, Krebs oder Zelltod führen können. Zellen reagieren auf DSB und andere DNA-Schäden mit einer Signalkaskade, die als DDR (DNA Damage Response) bezeichnet wird. Die AAA ATPase p97/VCP, welche in Verbindung mit dem Ubiquitin-System verschiedene zelluläre Funktionen ausübt, hat sich als wichtige Komponente der DDR erwiesen, da sie als Ubiquitin-abhängiger Remodeling-Faktor in der Umgebung von DSB wirkt. In dieser Arbeit wurde unter Anwendung von RNA-Interferenz (siRNA), ionisierender Strahlung (IR) und biochemischer Fraktionierung in humanen Zellen (HEK293) untersucht, wie die zentralen DDR-Proteine MDC1, BRCA1 und 53BP1, sowie Chromatin-assoziierte Polyubiquitin-Konjugate durch p97 beeinflusst werden. Es wurde beobachtet, dass die untersuchten DDR-Proteine nach Bestrahlung p97- unabhängig abgebaut werden. Hingegen kontrolliert p97 das zelluläre Niveau von 53BP1 sowie dessen Verbleib in der Chromatin-gebundenen Proteinfraktion. Zudem verursacht eine gestörte Funktion von p97 eine Akkumulation von Polyubiquitin- Konjugaten im Chromatin, was die Bedeutung von p97 für den Abbau Chromatin- assoziierter Proteine bestätigt. Da DDR-Proteine, p97 und das Ubiquitin-System bereits als pharmakologische Ziele für die Krebsbehandlung etabliert sind, besitzen diese Resultate potenzielle Relevanz für die Diagnostik, Prognostik und Therapie neoplastischer Erkrankungen.

DNA double strand breaks (DSBs) are life-threatening lesions which can lead to chromosomal rearrangements and consequently to genomic instability, cancer or cell death. Cells respond to DSBs and other types of DNA damage with a signaling cascade called DNA damage response (DDR) in order to repair the lesions or to induce apoptosis. The AAA ATPase p97/VCP, which has diverse cellular functions linked to the ubiquitin system, has recently emerged as a crucial player in the DDR, acting as an ubiquitin-dependent remodeling factor at sites of DSBs. In this study, we investigated how MDC1, BRCA1 and 53BP1, the central DDR proteins, as well as poly-ubiquitin conjugates on chromatin, are influenced by p97 using RNA interference (siRNA), γ-irradiation (IR) and biochemical fractionation in human embryonic kidney (HEK293) cells. We observed that the three monitored DDR proteins undergo degradation upon IR in a p97-independent manner. On the other hand, p97 is demonstrated to control the total cellular level of 53BP1 as well as its localization to the tightly chromatin-associated protein fraction. We also show that impaired p97 function leads to accumulation of poly-ubiquitin conjugates on chromatin and thus confirm the importance of p97 in chromatin-associated protein degradation. As DDR proteins, p97 and the ubiquitin system are already established as druggable targets for cancer treatment, our findings have potential relevance for diagnosis, prognosis and therapy of neoplastic diseases