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Cell-to-cell signalling in Burkholderia cenocepacia H111 : an entangled web of chemical languages


Schmid, Nadine. Cell-to-cell signalling in Burkholderia cenocepacia H111 : an entangled web of chemical languages. 2014, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Summary Burkholderia cenocepacia is a member of the Burkholderia cepacia complex (Bcc), a group of 17 phenotypically diverse but closely related species. Members of the Bcc are ubiquitously distributed in nature and occupy a broad range of ecological niches such as soil, water, the rhizosphere of plants, and they can be pathogens of animals and humans. This high versatility has been exploited for various purposes, including remediation of pollutants, biological control of plant pathogens and plant growth promotion. However, the great biotechnological potential of Bcc strains is severely hampered by the fact that all Bcc species have also been isolated from clinical sources, mainly from immunocompromised patients and persons suffering from cystic fibrosis (CF) or chronic granulomatous disease. Discrimination between environmental isolates and human pathogenic species is currently not possible. The expression of pathogenic traits in B. cenocepacia is at least partly controlled by quorum sensing (QS). Such cell-cell communication systems are used by many bacteria to perceive and respond to the density of their population to modulate gene expression accordingly. These bacterial communication systems rely on various structurally unrelated small signalling molecules. B. cenocepacia H111 employs two different QS molecules. The better characterized QS system relies on N-acyl-homoserine lactones (AHLs). At low population densities, the cells synthesize a basal level of AHLs via the activity of the AHL synthase CepI. With increasing cell density the signal molecule accumulates and on reaching a critical threshold concentration, the signal molecule binds to its cognate receptor, CepR, which in turn activates or represses the expression of target genes. In addition to the AHL based QS system, B. cenocepacia was shown to use a fatty acid derivative, cis-2-dodecenoic acid, as signalling molecule for the second QS system. BDSF (Burkholderia diffusible signal factor), is synthesized by the enoyl-CoA-hydratase RpfFBc. The focus of this thesis was to examine signal perception and transduction of BDSF. My work showed that rpfR, the gene adjacent to rpfFBc, encodes the main BDSF receptor in strain H111. RpfR consists of a PAS, a GGDEF and an EAL domain. The latter two are involved in c-di-GMP metabolism. RpfR is a bifunctional enzyme capable of both synthesizing and degrading c-di-GMP in vitro. In vivo, binding of BDSF to the PAS domain stimulates the phosphodiesterase activity of RpfR. The precise mechanism by which a lowered intracellular c-di-GMP concentration in turn results in altered gene expression still needs to be elucidated. But it is clear that various functions important for pathogenicity, including biofilm formation, motility and the secretion of extracellular hydrolytic enzymes, is affected. Importantly, cepI expression was found to be down-regulated when rpfR was inactivated, providing a link between the two QS systems in B. cenocepacia H111. My work showed that rather than being hierarchically arranged, the two QS systems act in parallel on specific as well as overlapping sets of genes. To further elucidate the influence of altered c-di-GMP levels on the physiology of B. cenocepacia H111, we artificially modified c-di-GMP levels in B. cenocepacia H111 and assessed the changes in global transcription patterns by RNA sequencing. I found that expression of approximately 1.5% of all genes are affected by c-di-GMP. This analysis confirmed that the c-di-GMP regulon partially overlaps with the BDSF- and the AHL- dependent QS regulons and showed that many pathogenic traits are negatively regulated by c-di-GMP. Consequently, a strain with highly increased c-di-GMP level was found to be severely attenuated in two non-mammalian infection models. Burkholderia cenocepacia gehört zum Burkholderia-cepacia-Komplex (Bcc), einer Gruppe von nah verwandten Bakterienarten, die allgegenwärtig sind und die unterschiedlichsten ökologischen Nischen, wie z.B. das Erdreich, Wasser und die Rhizosphäre besiedeln, und Tiere und Menschen infizieren können. Ihre Flexibilität wurde für verschiedene Zwecke, wie z.B. zur Bioremedation, zur biologischen Bekämpfung von Pflanzenpathogenen und für die Förderung des Pflanzenwachstums genutzt. Das grosse biotechnologische Potential von Bcc- Stämmen ist jedoch massiv beeinträchtigt durch die Tatsache, dass alle Bcc-Arten auch aus klinischen Quellen isoliert wurden. Besonders betroffen sind in diesem Zusammenhang immunsupprimierte Patienten und Personen, die an zystischer Fibrose oder an chronischer Granulomatose leiden. Eine Unterscheidung von Umweltisolaten und humanpathogenen Stämmen ist zurzeit nicht möglich. Die Ausbildung von Pathogenitätsmerkmalen in B. cenocepacia ist mindestens teilweise durch einen Mechanismus namens „Quorum Sensing“ (QS) kontrolliert. Diese Art der Zell- Zell-Kommunikation wird von vielen Bakterienarten verwendet und dient der Koordination der Genexpression in Abhängigkeit von der Zelldichte der Bakterienpopulation. Bakterielle Kommunikationssysteme bedienen sich verschiedener kleiner Signalmoleküle unterschiedlichster chemischer Natur. B. cenocepacia H111 verwendet zwei verschieden QS- Moleküle. Das besser untersuchte QS-System beruht auf N-Acyl-Homoserinlactonen (AHLs). Bei einer niedrigen Populationsdichte werden aufgrund einer basalen Expression der AHL- Synthase CepI geringe Mengen an AHLs synthetisiert. Wenn die Zelldichte ansteigt, akkumulieren die Signalmoleküle, um schliesslich beim Überschreiten einer Schwellenkonzentration an den Rezeptor CepR zu binden. Der CepR-AHL-Komplex aktiviert oder reprimiert in Folge die Expression von Zielgenen. Zusätzlich zu den AHLs verwendet B. cenocepacia ein Fettsäure-Derivat, cis-2- Dodecensäure, als Signalmolekül für das zweite QS-System. Dieses Signalmolekül, welches BDSF (Burkholderia diffusible signal factor) genannt wird, wird durch die Enoyl-CoA- Hydratase RpfFBc synthetisiert. Der Fokus dieser Doktorarbeit lag darin, die Signal- Erkennung und -Weitergabe des BDSF QS-Systems zu untersuchen. Wir konnten rpfR, ein Gen das direkt neben rpfFBc liegt, als BDSF-Rezeptor identifizieren. RpfR weist eine PAS-, eine GGDEF- und eine EAL-Domäne auf. Die beiden letzteren Domänen sind am Auf- und Abbau des sekundären Botenstoffes c-di-GMP beteiligt. Wir konnten zeigen, dass RpfR ein bifunktionelles Enzym ist, welches c-di-GMP sowohl synthetisieren wie auch degradieren kann. In der Zelle führt die Bindung von BDSF an die PAS-Domäne zu einer Konformationsänderung von RpfR, wodurch es zu einer Steigerung der Phophodiesterase- Aktivität kommt. Der genaue Mechanismus, wie eine reduzierte intrazelluläre c-di-GMP- Konzentration die Expression von Genen verändert, muss noch aufgeklärt werden. Es ist jedoch klar, dass eine Reihe von Genen, die für Pathogenitätsfaktoren, wie z.B. Biofilmbildung, Motilität oder die Ausscheidung von hydrolytischen Enzymen kodieren, davon betroffen sind. Unter anderem ist die Expression von cepI in der rpfR-Mutant herunterreguliert. Dies führt zu einer Verflechtung der beiden QS-Systemen, wobei meine Untersuchungen zeigten, dass die beiden QS-Systeme nicht hierarchisch organisiert sind, sondern parallel spezifische, wie auch überlappende Sets von Genen regulieren. Um den Einfluss von c-di-GMP auf die Physiologie von B. cenocepacia genauer zu untersuchen, haben wir mittels rekombinanter Plasmide die intrazelluläre c-di-GMP- Konzentration im B. cenocepacia H111 Wildtyp modifiziert und mittels RNA-Sequenzierung Effekte auf das Transkriptom analysiert. Mit dieser Herangehensweise identifizierten wir ca. 1.5 % aller Gene als c-di-GMP reguliert. Dies bestätigt, dass das c-di-GMP-Regulon mit den AHL- und BDSF-abhängigen Regulonen überlappt und dass viele Pathogenitätsfaktoren durch c-di-GMP negativ reguliert werden. Folgerichtig ist ein Burkholderia-Stamm mit massiv erhöhten intrazellulären c-di-GMP-Konzentrationen stark attenuiert in zwei Invertebraten-Infektionsmodellen.

Abstract

Summary Burkholderia cenocepacia is a member of the Burkholderia cepacia complex (Bcc), a group of 17 phenotypically diverse but closely related species. Members of the Bcc are ubiquitously distributed in nature and occupy a broad range of ecological niches such as soil, water, the rhizosphere of plants, and they can be pathogens of animals and humans. This high versatility has been exploited for various purposes, including remediation of pollutants, biological control of plant pathogens and plant growth promotion. However, the great biotechnological potential of Bcc strains is severely hampered by the fact that all Bcc species have also been isolated from clinical sources, mainly from immunocompromised patients and persons suffering from cystic fibrosis (CF) or chronic granulomatous disease. Discrimination between environmental isolates and human pathogenic species is currently not possible. The expression of pathogenic traits in B. cenocepacia is at least partly controlled by quorum sensing (QS). Such cell-cell communication systems are used by many bacteria to perceive and respond to the density of their population to modulate gene expression accordingly. These bacterial communication systems rely on various structurally unrelated small signalling molecules. B. cenocepacia H111 employs two different QS molecules. The better characterized QS system relies on N-acyl-homoserine lactones (AHLs). At low population densities, the cells synthesize a basal level of AHLs via the activity of the AHL synthase CepI. With increasing cell density the signal molecule accumulates and on reaching a critical threshold concentration, the signal molecule binds to its cognate receptor, CepR, which in turn activates or represses the expression of target genes. In addition to the AHL based QS system, B. cenocepacia was shown to use a fatty acid derivative, cis-2-dodecenoic acid, as signalling molecule for the second QS system. BDSF (Burkholderia diffusible signal factor), is synthesized by the enoyl-CoA-hydratase RpfFBc. The focus of this thesis was to examine signal perception and transduction of BDSF. My work showed that rpfR, the gene adjacent to rpfFBc, encodes the main BDSF receptor in strain H111. RpfR consists of a PAS, a GGDEF and an EAL domain. The latter two are involved in c-di-GMP metabolism. RpfR is a bifunctional enzyme capable of both synthesizing and degrading c-di-GMP in vitro. In vivo, binding of BDSF to the PAS domain stimulates the phosphodiesterase activity of RpfR. The precise mechanism by which a lowered intracellular c-di-GMP concentration in turn results in altered gene expression still needs to be elucidated. But it is clear that various functions important for pathogenicity, including biofilm formation, motility and the secretion of extracellular hydrolytic enzymes, is affected. Importantly, cepI expression was found to be down-regulated when rpfR was inactivated, providing a link between the two QS systems in B. cenocepacia H111. My work showed that rather than being hierarchically arranged, the two QS systems act in parallel on specific as well as overlapping sets of genes. To further elucidate the influence of altered c-di-GMP levels on the physiology of B. cenocepacia H111, we artificially modified c-di-GMP levels in B. cenocepacia H111 and assessed the changes in global transcription patterns by RNA sequencing. I found that expression of approximately 1.5% of all genes are affected by c-di-GMP. This analysis confirmed that the c-di-GMP regulon partially overlaps with the BDSF- and the AHL- dependent QS regulons and showed that many pathogenic traits are negatively regulated by c-di-GMP. Consequently, a strain with highly increased c-di-GMP level was found to be severely attenuated in two non-mammalian infection models. Burkholderia cenocepacia gehört zum Burkholderia-cepacia-Komplex (Bcc), einer Gruppe von nah verwandten Bakterienarten, die allgegenwärtig sind und die unterschiedlichsten ökologischen Nischen, wie z.B. das Erdreich, Wasser und die Rhizosphäre besiedeln, und Tiere und Menschen infizieren können. Ihre Flexibilität wurde für verschiedene Zwecke, wie z.B. zur Bioremedation, zur biologischen Bekämpfung von Pflanzenpathogenen und für die Förderung des Pflanzenwachstums genutzt. Das grosse biotechnologische Potential von Bcc- Stämmen ist jedoch massiv beeinträchtigt durch die Tatsache, dass alle Bcc-Arten auch aus klinischen Quellen isoliert wurden. Besonders betroffen sind in diesem Zusammenhang immunsupprimierte Patienten und Personen, die an zystischer Fibrose oder an chronischer Granulomatose leiden. Eine Unterscheidung von Umweltisolaten und humanpathogenen Stämmen ist zurzeit nicht möglich. Die Ausbildung von Pathogenitätsmerkmalen in B. cenocepacia ist mindestens teilweise durch einen Mechanismus namens „Quorum Sensing“ (QS) kontrolliert. Diese Art der Zell- Zell-Kommunikation wird von vielen Bakterienarten verwendet und dient der Koordination der Genexpression in Abhängigkeit von der Zelldichte der Bakterienpopulation. Bakterielle Kommunikationssysteme bedienen sich verschiedener kleiner Signalmoleküle unterschiedlichster chemischer Natur. B. cenocepacia H111 verwendet zwei verschieden QS- Moleküle. Das besser untersuchte QS-System beruht auf N-Acyl-Homoserinlactonen (AHLs). Bei einer niedrigen Populationsdichte werden aufgrund einer basalen Expression der AHL- Synthase CepI geringe Mengen an AHLs synthetisiert. Wenn die Zelldichte ansteigt, akkumulieren die Signalmoleküle, um schliesslich beim Überschreiten einer Schwellenkonzentration an den Rezeptor CepR zu binden. Der CepR-AHL-Komplex aktiviert oder reprimiert in Folge die Expression von Zielgenen. Zusätzlich zu den AHLs verwendet B. cenocepacia ein Fettsäure-Derivat, cis-2- Dodecensäure, als Signalmolekül für das zweite QS-System. Dieses Signalmolekül, welches BDSF (Burkholderia diffusible signal factor) genannt wird, wird durch die Enoyl-CoA- Hydratase RpfFBc synthetisiert. Der Fokus dieser Doktorarbeit lag darin, die Signal- Erkennung und -Weitergabe des BDSF QS-Systems zu untersuchen. Wir konnten rpfR, ein Gen das direkt neben rpfFBc liegt, als BDSF-Rezeptor identifizieren. RpfR weist eine PAS-, eine GGDEF- und eine EAL-Domäne auf. Die beiden letzteren Domänen sind am Auf- und Abbau des sekundären Botenstoffes c-di-GMP beteiligt. Wir konnten zeigen, dass RpfR ein bifunktionelles Enzym ist, welches c-di-GMP sowohl synthetisieren wie auch degradieren kann. In der Zelle führt die Bindung von BDSF an die PAS-Domäne zu einer Konformationsänderung von RpfR, wodurch es zu einer Steigerung der Phophodiesterase- Aktivität kommt. Der genaue Mechanismus, wie eine reduzierte intrazelluläre c-di-GMP- Konzentration die Expression von Genen verändert, muss noch aufgeklärt werden. Es ist jedoch klar, dass eine Reihe von Genen, die für Pathogenitätsfaktoren, wie z.B. Biofilmbildung, Motilität oder die Ausscheidung von hydrolytischen Enzymen kodieren, davon betroffen sind. Unter anderem ist die Expression von cepI in der rpfR-Mutant herunterreguliert. Dies führt zu einer Verflechtung der beiden QS-Systemen, wobei meine Untersuchungen zeigten, dass die beiden QS-Systeme nicht hierarchisch organisiert sind, sondern parallel spezifische, wie auch überlappende Sets von Genen regulieren. Um den Einfluss von c-di-GMP auf die Physiologie von B. cenocepacia genauer zu untersuchen, haben wir mittels rekombinanter Plasmide die intrazelluläre c-di-GMP- Konzentration im B. cenocepacia H111 Wildtyp modifiziert und mittels RNA-Sequenzierung Effekte auf das Transkriptom analysiert. Mit dieser Herangehensweise identifizierten wir ca. 1.5 % aller Gene als c-di-GMP reguliert. Dies bestätigt, dass das c-di-GMP-Regulon mit den AHL- und BDSF-abhängigen Regulonen überlappt und dass viele Pathogenitätsfaktoren durch c-di-GMP negativ reguliert werden. Folgerichtig ist ein Burkholderia-Stamm mit massiv erhöhten intrazellulären c-di-GMP-Konzentrationen stark attenuiert in zwei Invertebraten-Infektionsmodellen.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Eberl Leo, Pernthaler Jakob
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2014
Deposited On:02 Apr 2019 15:45
Last Modified:28 Oct 2019 08:27
Number of Pages:120
OA Status:Green
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