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Molecular and cellular aspects of DNA-end resection by human CtlP


Murina, Olga. Molecular and cellular aspects of DNA-end resection by human CtlP. 2014, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Die Erbinformation (DNA) in unseren Zellen wird durch eine Vielzahl von Umwelteinflüssen konstant beschädigt. DNA Doppelstrangbrüche (DSB) gehören zu den gefährlichsten aller DNA Schäden, weil sie ohne Reparatur zum Tod einer Zelle führen können. Zudem besteht eine direkte Verbindung zwischen falscher DSB Reparatur und Krebs. Zellen besitzen zwei verschiedene Systeme für die DSB Reparatur: Nicht- homologe Enden-Verknüpfung (NHEJ) und Homologe Rekombination (HR). Im Unterschied zu NHEJ, müssen für HR die Enden der Brüche zuerst prozessiert werden, sodass einzelsträngige DNA Überhänge entstehen. An diesem Schritt, der als 'DNA- Endresektion' bezeichnet wird, ist das CtIP Protein massgeblich beteiligt. Der erste Teil meiner Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Frage ob CtIP auch in der Reparatur von kovalent-quervernetzten DNA Strängen, sogenannten 'interstrand crosslinks' (ICL), eine Rolle spielt und ob ein Zusammenspiel zwischen DNA- Endresektion und dem Fanconi anemia (FA) Signalweg existiert. Die FA-Proteine steuern die komplexe Reparatur von ICLs, indem sie diese im Chromatin erkennen, prozessieren und, in Zusammenarbeit mit anderen Reparatursystemen inklusive der HR, korrigieren. Wir zeigen, dass die Bindung von CtIP an ICL-geschädigtes Chromatin von der Funktion des FA-Kernkomplexes und der Mono-Ubiquitinierung des FANCD2 Proteins abhängig ist. Wir legen außerdem dar, dass die Lokalisierung von CtIP an ICLs durch die direkte Interaktion von CtIP mit FANCD2 vermittelt und möglicherweise durch die Fähigkeit von CtIP ubiquitinierte Substrate zu binden verstärkt wird. Bemerkenswerterweise haben Zellen in denen FANCD2 inaktiviert ist, einen ähnlichen Defekt in der DNA-Endresektion wie CtIP-defiziente Zellen. Zudem haben wir eine FANCD2-Bindestelle innerhalb des CtIP Proteins identifizieren können, welche für eine fehlerfreie Reparatur von ICLs erforderlich ist und somit potentielle, durch NHEJ- verursachte, chromosomale Aberrationen verhindert. Interessant ist auch, dass charakteristische Phänotypen von FANCD2-defizienten Zellen, wie genomische Instabilität und Hypersensitivität gegenüber ICL-induzierenden Stoffen, durch eine zusätzlichen Verlust von CtIP verschlimmert werden. Daraus schließen wir, dass CtIP auch in Abwesenheit von FANCD2 eine bedeutende Funktion für die ICL Reparatur hat. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass FANCD2 ein wichtiger Regulator der CtIP- vermittelten DNA-Endresektion darstellt und dass CtIP eine essenzielle Rolle in der Aufrechterhaltung der Stabilität unseres Genoms spielt. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit untersuchen wir eine spezielle Klasse von Mutationen des menschlichen RAD50 Proteins, genannt RAD50S, die in Hefe zu einer Trennung verschiedener Funktionalitäten des Proteins führt. Bei RAD50 handelt es sich um eine Untereinheit des MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) Komplexes, der mit CtIP interagiert und mehrere Aufgaben in der DSB Reparatur spielt. Wir zeigen, dass RAD50S Mutationen die DNA-Endresektion und DSB Reparatur beeinträchtigt, vor allem wenn Zellen mit DNA Topoisomerase-hemmenden Substanzen behandelt werden. RAD50S Mutationen führten jedoch weder zu einer veränderten Struktur des MRN Komplexes, noch zu einer Beeinträchtigung MRN-abhängiger Signalwege nach Behandlung von Zellen mit anderen DNA-schädigenden Substanzen. Basierend auf unseren biochemischen Daten kommen wir zum Schluss, dass die von uns beobachteten zellulären Phänotypen höchstwahrscheinlich durch eine Störung der Interaktion zwischen RAD50S und CtIP hervorgerufen werden, welche besonders für die Reparatur blockierter Topoisomerase Moleküle an DSB Enden von Bedeutung ist. Beide Studien eingeschlossen, belegen unsere Ergebnisse dass CtIP durch Interaktionen mit FANCD2 und RAD50 eine Schlüsselrolle bei der Reparatur von DNA Schäden spielt und somit womöglich ein wichtiger Faktor zur Verhinderung von Krebs ist.
SUMMARY Our genome is under constant threat from DNA damage that inflicts different kinds of lesions including DNA double-strand breaks (DSBs). Failure to correctly repair DSBs can cause gross chromosomal aberrations, which are a hallmark of cancer. Cells have evolved two major pathways to repair DSBs: non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Human CtIP promotes DNA-end resection, which commits cells to error-free HR and prevents aberrant repair by NHEJ, hence it is a critical determinant of DSB repair pathway choice. However, the cellular response to DNA damage involves a complex interplay between different genome maintenance pathways and the role of CtIP in this multifaceted network is still poorly understood. In the first part of my PhD study, we addressed the functional interplay between CtIP- dependent resection and the Fanconi anemia (FA) pathway during the repair of DNA interstrand crosslinks (ICLs). Fanconi anemia is an inherited disorder associated with a high risk to develop cancer and is caused by mutations in sixteen FA genes. Together, the FA proteins orchestrate ICL incision, translesion synthesis and HR. We demonstrate that chromatin association of CtIP in response to ICL-induced damage is strictly dependent on a functional FA core complex and FANCD2 monoubiquitination. Furthermore, we show that CtIP recruitment to ICL lesions is mediated by its direct interaction with FANCD2 and might be further reinforced by the discovered ability of CtIP to recognize ubiquitinated substrates. Remarkably, cells lacking FANCD2 akin to CtIP-depleted cells are impaired in DNA-end resection. We have identified FANCD2-binding sites on CtIP and provide evidence that CtIP- FANCD2 complex is required for the faithful repair of ICLs, meanwhile counteracting mutagenic NHEJ pathway. Interestingly, the phenotypes of FA cells such as genome instability and ICL hypersensitivity are further aggravated by CtIP depletion, indicating the significance of CtIP even in the absence of proficient FA pathway. Taken together, our data establish FANCD2 as a critical regulator of CtIP-mediated DNA-end resection and emphasize the essential role of CtIP in maintaining genome stability in response to ICL damage. In the second part, we examined the phenotypes of the separation-of-function (S) mutations in human RAD50, a subunit of the MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex that interacts with CtIP and plays crucial roles in DSB signaling and processing. We demonstrate that RAD50S mutants compromise resection and repair of DSBs induced specifically by DNA topoisomerase poisons, but do neither alter MRN complex integrity nor significantly affect MRN-dependent signaling in response to other types of DNA damaging agents. Based on our biochemical data we suggest that these phenotypes are caused by the impaired interaction between RAD50S mutants and CtIP, which is particularly important for the processing of topoisomerases trapped to DNA ends. Collectively, our results establish a key role for CtIP in the repair of ICLs and also highlight the significance of CtIP-MRN association for the processing of toxic protein-DNA adducts. Work presented in my thesis thus advances the understanding of how the DNA-end resection activity of CtIP is regulated to preserve genome stability.

Abstract

Die Erbinformation (DNA) in unseren Zellen wird durch eine Vielzahl von Umwelteinflüssen konstant beschädigt. DNA Doppelstrangbrüche (DSB) gehören zu den gefährlichsten aller DNA Schäden, weil sie ohne Reparatur zum Tod einer Zelle führen können. Zudem besteht eine direkte Verbindung zwischen falscher DSB Reparatur und Krebs. Zellen besitzen zwei verschiedene Systeme für die DSB Reparatur: Nicht- homologe Enden-Verknüpfung (NHEJ) und Homologe Rekombination (HR). Im Unterschied zu NHEJ, müssen für HR die Enden der Brüche zuerst prozessiert werden, sodass einzelsträngige DNA Überhänge entstehen. An diesem Schritt, der als 'DNA- Endresektion' bezeichnet wird, ist das CtIP Protein massgeblich beteiligt. Der erste Teil meiner Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Frage ob CtIP auch in der Reparatur von kovalent-quervernetzten DNA Strängen, sogenannten 'interstrand crosslinks' (ICL), eine Rolle spielt und ob ein Zusammenspiel zwischen DNA- Endresektion und dem Fanconi anemia (FA) Signalweg existiert. Die FA-Proteine steuern die komplexe Reparatur von ICLs, indem sie diese im Chromatin erkennen, prozessieren und, in Zusammenarbeit mit anderen Reparatursystemen inklusive der HR, korrigieren. Wir zeigen, dass die Bindung von CtIP an ICL-geschädigtes Chromatin von der Funktion des FA-Kernkomplexes und der Mono-Ubiquitinierung des FANCD2 Proteins abhängig ist. Wir legen außerdem dar, dass die Lokalisierung von CtIP an ICLs durch die direkte Interaktion von CtIP mit FANCD2 vermittelt und möglicherweise durch die Fähigkeit von CtIP ubiquitinierte Substrate zu binden verstärkt wird. Bemerkenswerterweise haben Zellen in denen FANCD2 inaktiviert ist, einen ähnlichen Defekt in der DNA-Endresektion wie CtIP-defiziente Zellen. Zudem haben wir eine FANCD2-Bindestelle innerhalb des CtIP Proteins identifizieren können, welche für eine fehlerfreie Reparatur von ICLs erforderlich ist und somit potentielle, durch NHEJ- verursachte, chromosomale Aberrationen verhindert. Interessant ist auch, dass charakteristische Phänotypen von FANCD2-defizienten Zellen, wie genomische Instabilität und Hypersensitivität gegenüber ICL-induzierenden Stoffen, durch eine zusätzlichen Verlust von CtIP verschlimmert werden. Daraus schließen wir, dass CtIP auch in Abwesenheit von FANCD2 eine bedeutende Funktion für die ICL Reparatur hat. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass FANCD2 ein wichtiger Regulator der CtIP- vermittelten DNA-Endresektion darstellt und dass CtIP eine essenzielle Rolle in der Aufrechterhaltung der Stabilität unseres Genoms spielt. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit untersuchen wir eine spezielle Klasse von Mutationen des menschlichen RAD50 Proteins, genannt RAD50S, die in Hefe zu einer Trennung verschiedener Funktionalitäten des Proteins führt. Bei RAD50 handelt es sich um eine Untereinheit des MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) Komplexes, der mit CtIP interagiert und mehrere Aufgaben in der DSB Reparatur spielt. Wir zeigen, dass RAD50S Mutationen die DNA-Endresektion und DSB Reparatur beeinträchtigt, vor allem wenn Zellen mit DNA Topoisomerase-hemmenden Substanzen behandelt werden. RAD50S Mutationen führten jedoch weder zu einer veränderten Struktur des MRN Komplexes, noch zu einer Beeinträchtigung MRN-abhängiger Signalwege nach Behandlung von Zellen mit anderen DNA-schädigenden Substanzen. Basierend auf unseren biochemischen Daten kommen wir zum Schluss, dass die von uns beobachteten zellulären Phänotypen höchstwahrscheinlich durch eine Störung der Interaktion zwischen RAD50S und CtIP hervorgerufen werden, welche besonders für die Reparatur blockierter Topoisomerase Moleküle an DSB Enden von Bedeutung ist. Beide Studien eingeschlossen, belegen unsere Ergebnisse dass CtIP durch Interaktionen mit FANCD2 und RAD50 eine Schlüsselrolle bei der Reparatur von DNA Schäden spielt und somit womöglich ein wichtiger Faktor zur Verhinderung von Krebs ist.
SUMMARY Our genome is under constant threat from DNA damage that inflicts different kinds of lesions including DNA double-strand breaks (DSBs). Failure to correctly repair DSBs can cause gross chromosomal aberrations, which are a hallmark of cancer. Cells have evolved two major pathways to repair DSBs: non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Human CtIP promotes DNA-end resection, which commits cells to error-free HR and prevents aberrant repair by NHEJ, hence it is a critical determinant of DSB repair pathway choice. However, the cellular response to DNA damage involves a complex interplay between different genome maintenance pathways and the role of CtIP in this multifaceted network is still poorly understood. In the first part of my PhD study, we addressed the functional interplay between CtIP- dependent resection and the Fanconi anemia (FA) pathway during the repair of DNA interstrand crosslinks (ICLs). Fanconi anemia is an inherited disorder associated with a high risk to develop cancer and is caused by mutations in sixteen FA genes. Together, the FA proteins orchestrate ICL incision, translesion synthesis and HR. We demonstrate that chromatin association of CtIP in response to ICL-induced damage is strictly dependent on a functional FA core complex and FANCD2 monoubiquitination. Furthermore, we show that CtIP recruitment to ICL lesions is mediated by its direct interaction with FANCD2 and might be further reinforced by the discovered ability of CtIP to recognize ubiquitinated substrates. Remarkably, cells lacking FANCD2 akin to CtIP-depleted cells are impaired in DNA-end resection. We have identified FANCD2-binding sites on CtIP and provide evidence that CtIP- FANCD2 complex is required for the faithful repair of ICLs, meanwhile counteracting mutagenic NHEJ pathway. Interestingly, the phenotypes of FA cells such as genome instability and ICL hypersensitivity are further aggravated by CtIP depletion, indicating the significance of CtIP even in the absence of proficient FA pathway. Taken together, our data establish FANCD2 as a critical regulator of CtIP-mediated DNA-end resection and emphasize the essential role of CtIP in maintaining genome stability in response to ICL damage. In the second part, we examined the phenotypes of the separation-of-function (S) mutations in human RAD50, a subunit of the MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex that interacts with CtIP and plays crucial roles in DSB signaling and processing. We demonstrate that RAD50S mutants compromise resection and repair of DSBs induced specifically by DNA topoisomerase poisons, but do neither alter MRN complex integrity nor significantly affect MRN-dependent signaling in response to other types of DNA damaging agents. Based on our biochemical data we suggest that these phenotypes are caused by the impaired interaction between RAD50S mutants and CtIP, which is particularly important for the processing of topoisomerases trapped to DNA ends. Collectively, our results establish a key role for CtIP in the repair of ICLs and also highlight the significance of CtIP-MRN association for the processing of toxic protein-DNA adducts. Work presented in my thesis thus advances the understanding of how the DNA-end resection activity of CtIP is regulated to preserve genome stability.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Sartori Alessandro A
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2014
Deposited On:02 Apr 2019 15:51
Last Modified:25 Sep 2019 00:14
Number of Pages:137
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod010268096&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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