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The bioengineering of human blood and lymphatic capillaries in dermo-epidermal skin substitutes


Luginbühl, Joachim. The bioengineering of human blood and lymphatic capillaries in dermo-epidermal skin substitutes. 2014, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Slow vascularization of bioengineered organs after transplantation constitutes a major hurdle in tissue engineering and regenerative medicine. Providing these organs with functional blood and lymphatic capillaries prior to transplantation (henceforth referred to as prevascularization) may be an attractive solution for this problem, given that the bioengineered capillaries rapidly connect to the recipient’s vasculature in the wound bed. Despite considerable progress in the bioengineering of functional blood capillaries, no data were available neither on the bioengineering of functional human lymphatic capillaries, nor on the integration of a dermal lymphatic network into a skin substitute. Moreover, it remained largely unknown how pre-existing blood and lymphatic capillaries affect the reconstitution of a dermo-epidermal skin substitute (DESS) after its transplantation. The first part of my work aimed at bioengineering prevascularized DESS (PDESS) containing physiologically distinct blood and lymphatic capillaries. For this, human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC), dermal fibroblasts and epidermal keratinocytes isolated from human skin biopsies were sequentially seeded into and onto rapidly polymerizing fibrin hydrogels. Within 3 weeks of in vitro culture, lumenized and interconnected capillary networks consisting of blood and lymphatic capillaries spontaneously assembled within PDESS. I found that during the process of prevascularization, the inoculated fibroblasts differentiated into pericytes and specifically stabilized blood capillaries, while they hardly associated with lymphatic capillaries. The lymphatic capillaries presented anchoring filaments, expressed all major lymphatic markers, and could be modulated by lymphangiogenic and anti-lymphangiogenic stimuli. In addition, the lymphatic capillaries took up fluid from the interstitial space in vitro and improved the drainage of fluids from PDESS in vivo. Analysis of PDESS after transplantation revealed a great acceleration of vascular regeneration involving two distinct mechanisms: rapid anastomosis of the bioengineered blood capillaries - followed by lymphatic anastomosis - and accelerated recipient blood and lymphatic angiogenesis.
In the second part of this work, I performed a broad analysis of the effects of prevascularization on several aspects of wound healing and skin morphogenesis of DESS. By comparison of PDESS and non-prevascularized DESS (NPDESS) in vivo, I found that the rapid perfusion of the bioengineered blood capillary network increased proliferation and decreased apoptosis of transplanted cells, reduced graft shrinkage, induced the formation of rete ridges and capillary loops and promoted dermal remodelling. Furthermore, PDESS healed by the deposition of randomized collagen bundles instead of the scar-like parallel collagen bundle orientation found after transplantation of NPDESS. Collectively, my data for the first time describe the bioengineering of clinically relevant PDESS containing human blood and lymphatic capillary networks that rapidly connect with the host vasculature after transplantation, thereby markedly accelerating perfusion of the graft. In vitro and in vivo studies indicate that the rapid perfusion of PDESS unlocks latent regenerative processes that shift the healing of DESS from typical scar formation towards regeneration.
Die langsame Vaskularisierung künstlicher Organe stellt ein gravierendes Problem im Bereich Tissue engineering und Regenerative Medizin dar. Das Versetzen solcher Organe mit funktionalen Blut- und lymphatischen Gefässen vor der Transplantation (Prevascularization) repräsentiert eine attraktive Lösung für dieses Problem, bedingt jedoch, dass sich die künstlichen Gefässe nach der Transplantation schnell mit den Gefässen des Empfängers verbinden (Anastomose). Trotz bemerkenswerter Fortschritte in der Herstellung künstlicher Blutgefässe gab es bisher keine Berichte über die Herstellung von funktionalen lymphatischen Gefässen oder über die Versetzung von dermo- epidermalen Hautsubstituten (DESS) mit solchen lymphatischen Gefässen. Ausserdem war nur sehr wenig über den Effekt von konstruierten Blut- und lymphatischen Gefässen auf den Heilungsprozess eines dermo-epidermalen Hautersatzes bekannt. Das Ziel des ersten Teils meiner Arbeit war die Herstellung von prevaskularisierten dermo-epidermalen Hautsubstituten (PDESS), die künstliche Blut- und lymphatische Gefässe beinhalten. Dafür wurden human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC), dermale Fibroblasten und epidermale Keratinocyten von einer Hautbiopsie isoliert und zuerst in und dann auf ein schnell polymerisierendes Fibrin Hydrogel gesäht. Innert 3 Wochen entstand so spontan ein Netzwerk verbundener Kapillaren mit Lumen, bestehend aus Blut- und lymphatischen Gefässen. Die Fibroblasten differenzierten während der Prevaskularisierung zu Perizyten und stabilisierten spezifisch die Blutkapillaren, während sie kaum mit lymphatischen Gefässen assoziierten. Die lymphatischen Gefässe entwickelten Anchoring filaments, exprimierten alle wichtigen lymphatischen Marker und konnten mittels lymphangiogenen und anti-lymphangiogenen Stimuli moduliert werden. Ausserdem waren sie fähig zur Flüssigkeitsaufnahme in vitro und verbesserten den Flüssigkeits-Abtransport in vivo. Die Analyse von PDESS nach der Transplantation hat gezeigt, dass Prevaskularisierung die vaskuläre Regeneration mittels zwei verschiedener Mechanismen beschleunigt: schnelle Anastomose der Blutgefässe – gefolgt von der Anastomose der lymphatischen Gefässe – und Beschleunigung des Einwuchses von Blut und lymphatischen Gefässen des Empfängers in das Hautsubstitut. Im zweiten Teil meiner Arbeit führte ich eine ausgiebige Analyse der Effekte von Prevaskularisierung auf die Heilung und Hautmorphogenese von PDESS durch. Mittels eines Vergleichs von PDESS und nicht-prevaskularisierten DESS (NPDESS) in vivo habe ich herausgefunden, dass die schnelle Perfusion der künstlichen Blutgefässe die Proliferation der transplantierten Zellen unterstützt und deren Apoptose vermindert, die Schrumpfung des Hautsubstituts reduziert, die Entwicklung von Rete ridges und Capillary Loops induziert und das dermale Remodelling fördert. Ausserdem heilten PDESS mittels Deposition von zufällig orientierten Kollagenbündeln anstatt von parallelen, Narben- Kollagenbündeln wie nach der Transplantation von NPDESS. Diese Arbeit beschreibt zum ersten Mal ein klinisch relevantes dermo-epidermales Hautsubstitut, welches sowohl Blut- als auch lymphatische Gefässe beinhaltet, durch deren schnelle Anastomose die Perfusion des Transplantats merklich beschleunigt wird. In vitro und in vivo Studien deuten darauf hin, dass die schnelle Perfusion ruhende regenerative Prozesse in PDESS aktiviert, welche den Heilungsprozess von einer typischen Narbenformation in Richtung Regeneration leiten.

Abstract

Slow vascularization of bioengineered organs after transplantation constitutes a major hurdle in tissue engineering and regenerative medicine. Providing these organs with functional blood and lymphatic capillaries prior to transplantation (henceforth referred to as prevascularization) may be an attractive solution for this problem, given that the bioengineered capillaries rapidly connect to the recipient’s vasculature in the wound bed. Despite considerable progress in the bioengineering of functional blood capillaries, no data were available neither on the bioengineering of functional human lymphatic capillaries, nor on the integration of a dermal lymphatic network into a skin substitute. Moreover, it remained largely unknown how pre-existing blood and lymphatic capillaries affect the reconstitution of a dermo-epidermal skin substitute (DESS) after its transplantation. The first part of my work aimed at bioengineering prevascularized DESS (PDESS) containing physiologically distinct blood and lymphatic capillaries. For this, human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC), dermal fibroblasts and epidermal keratinocytes isolated from human skin biopsies were sequentially seeded into and onto rapidly polymerizing fibrin hydrogels. Within 3 weeks of in vitro culture, lumenized and interconnected capillary networks consisting of blood and lymphatic capillaries spontaneously assembled within PDESS. I found that during the process of prevascularization, the inoculated fibroblasts differentiated into pericytes and specifically stabilized blood capillaries, while they hardly associated with lymphatic capillaries. The lymphatic capillaries presented anchoring filaments, expressed all major lymphatic markers, and could be modulated by lymphangiogenic and anti-lymphangiogenic stimuli. In addition, the lymphatic capillaries took up fluid from the interstitial space in vitro and improved the drainage of fluids from PDESS in vivo. Analysis of PDESS after transplantation revealed a great acceleration of vascular regeneration involving two distinct mechanisms: rapid anastomosis of the bioengineered blood capillaries - followed by lymphatic anastomosis - and accelerated recipient blood and lymphatic angiogenesis.
In the second part of this work, I performed a broad analysis of the effects of prevascularization on several aspects of wound healing and skin morphogenesis of DESS. By comparison of PDESS and non-prevascularized DESS (NPDESS) in vivo, I found that the rapid perfusion of the bioengineered blood capillary network increased proliferation and decreased apoptosis of transplanted cells, reduced graft shrinkage, induced the formation of rete ridges and capillary loops and promoted dermal remodelling. Furthermore, PDESS healed by the deposition of randomized collagen bundles instead of the scar-like parallel collagen bundle orientation found after transplantation of NPDESS. Collectively, my data for the first time describe the bioengineering of clinically relevant PDESS containing human blood and lymphatic capillary networks that rapidly connect with the host vasculature after transplantation, thereby markedly accelerating perfusion of the graft. In vitro and in vivo studies indicate that the rapid perfusion of PDESS unlocks latent regenerative processes that shift the healing of DESS from typical scar formation towards regeneration.
Die langsame Vaskularisierung künstlicher Organe stellt ein gravierendes Problem im Bereich Tissue engineering und Regenerative Medizin dar. Das Versetzen solcher Organe mit funktionalen Blut- und lymphatischen Gefässen vor der Transplantation (Prevascularization) repräsentiert eine attraktive Lösung für dieses Problem, bedingt jedoch, dass sich die künstlichen Gefässe nach der Transplantation schnell mit den Gefässen des Empfängers verbinden (Anastomose). Trotz bemerkenswerter Fortschritte in der Herstellung künstlicher Blutgefässe gab es bisher keine Berichte über die Herstellung von funktionalen lymphatischen Gefässen oder über die Versetzung von dermo- epidermalen Hautsubstituten (DESS) mit solchen lymphatischen Gefässen. Ausserdem war nur sehr wenig über den Effekt von konstruierten Blut- und lymphatischen Gefässen auf den Heilungsprozess eines dermo-epidermalen Hautersatzes bekannt. Das Ziel des ersten Teils meiner Arbeit war die Herstellung von prevaskularisierten dermo-epidermalen Hautsubstituten (PDESS), die künstliche Blut- und lymphatische Gefässe beinhalten. Dafür wurden human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC), dermale Fibroblasten und epidermale Keratinocyten von einer Hautbiopsie isoliert und zuerst in und dann auf ein schnell polymerisierendes Fibrin Hydrogel gesäht. Innert 3 Wochen entstand so spontan ein Netzwerk verbundener Kapillaren mit Lumen, bestehend aus Blut- und lymphatischen Gefässen. Die Fibroblasten differenzierten während der Prevaskularisierung zu Perizyten und stabilisierten spezifisch die Blutkapillaren, während sie kaum mit lymphatischen Gefässen assoziierten. Die lymphatischen Gefässe entwickelten Anchoring filaments, exprimierten alle wichtigen lymphatischen Marker und konnten mittels lymphangiogenen und anti-lymphangiogenen Stimuli moduliert werden. Ausserdem waren sie fähig zur Flüssigkeitsaufnahme in vitro und verbesserten den Flüssigkeits-Abtransport in vivo. Die Analyse von PDESS nach der Transplantation hat gezeigt, dass Prevaskularisierung die vaskuläre Regeneration mittels zwei verschiedener Mechanismen beschleunigt: schnelle Anastomose der Blutgefässe – gefolgt von der Anastomose der lymphatischen Gefässe – und Beschleunigung des Einwuchses von Blut und lymphatischen Gefässen des Empfängers in das Hautsubstitut. Im zweiten Teil meiner Arbeit führte ich eine ausgiebige Analyse der Effekte von Prevaskularisierung auf die Heilung und Hautmorphogenese von PDESS durch. Mittels eines Vergleichs von PDESS und nicht-prevaskularisierten DESS (NPDESS) in vivo habe ich herausgefunden, dass die schnelle Perfusion der künstlichen Blutgefässe die Proliferation der transplantierten Zellen unterstützt und deren Apoptose vermindert, die Schrumpfung des Hautsubstituts reduziert, die Entwicklung von Rete ridges und Capillary Loops induziert und das dermale Remodelling fördert. Ausserdem heilten PDESS mittels Deposition von zufällig orientierten Kollagenbündeln anstatt von parallelen, Narben- Kollagenbündeln wie nach der Transplantation von NPDESS. Diese Arbeit beschreibt zum ersten Mal ein klinisch relevantes dermo-epidermales Hautsubstitut, welches sowohl Blut- als auch lymphatische Gefässe beinhaltet, durch deren schnelle Anastomose die Perfusion des Transplantats merklich beschleunigt wird. In vitro und in vivo Studien deuten darauf hin, dass die schnelle Perfusion ruhende regenerative Prozesse in PDESS aktiviert, welche den Heilungsprozess von einer typischen Narbenformation in Richtung Regeneration leiten.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Dummer Reinhard, Gassmann Max
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2014
Deposited On:04 Apr 2019 06:20
Last Modified:15 Apr 2021 15:01
Number of Pages:125
OA Status:Green

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