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Tissue-engineered skin grafts prevascularized with adipose-derived cells


Klar, Agnieszka. Tissue-engineered skin grafts prevascularized with adipose-derived cells. 2014, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Survival of cells within a transplanted skin substitute is dependent on the diffusion of nutrients and oxygen from the underlying wound site. Thus, formation of mature capillary networks in vitro in the skin substitute, so called prevascularization, is a promising approach to overcome this limitation. For this purpose I investigated human adipose-derived stem cells as a novel cell source for the tissue-engineering of prevascularized skin substitutes. The so called stromal-vascular fraction (SVF) isolated from adipose tissue is a heterogeneous cell population including mesenchymal and endothelial cells but is depleted from mature adipocytes. I observed that both endothelial and mesenchymal cells present in the SVF assembled into a dense, microvascular network when submerged within fibrin hydrogels [1]. I also found that human tissue-engineered capillaries were already stabilized in vitro by perivascular cells (pericytes) as illustrated by a staining for pericyte specific markers such as α-smooth muscle actin (αSMA) and neuron-glial antigen 2 (NG2). Most importantly, I demonstrated that SVF-derived capillary networks present in the prevascularized skin substitutes had the potential to connect to the host vasculature (by inosculation) within 3-4 days after transplantation onto the backs of immuno-incompetent rats. In contrast, transplantation of non-prevascularized controls, lacking endothelial cells, resulted in a delayed ingrowth of rat vessels and graft perfusion, which was not observed before day 14 after transplantation. Moreover, I examined the effects associated with rapid graft perfusion in vivo regarding the regeneration of the dermal and epidermal skin compartment. Skin substitutes prevascularized by cells of the SVF demonstrated an increased graft size after transplantation, as well as an enhanced collagen type I deposition in the dermal compartment. Furthermore, I evaluated the expression of tissue homeostasis and wound healing markers in the epidermis. The staining for cytokeratin 16 and 17 (wound healing markers) revealed that the period of wound healing could be dramatically decreased in the prevascularized skin grafts. Expression of cytokeratin 19 (skin homeostasis marker) restricted to the basal keratinocyte layer rather than also expressed in several suprabasal layers, demonstrated that graft prevascularization contributed to a faster epidermal homeostasis. In the second part of my work, I have characterized different features of tissue- engineered skin substitutes regarding our future clinical trial. In this regard, I was able to contribute to the optimization of the protocol for the production of skin substitutes to shorten their total culture time from 21 to 12 days [2].
Das Überleben der Zellen innerhalb eines transplantierten Haut-Substituts ist abhängig von adäquater Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff, Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Hormonen ausgehend vom darunter liegenden Wundbett. Deshalb ist die Bildung reifer Kapillarnetzwerke in vitro in dem Haut-Substitut (eine sogenannte Prä-Vaskularisierung) ein viel versprechender Ansatz, um diese Einschränkung zu überwinden. Zu diesem Zweck untersuchte ich die aus menschlichem Fettgewebe gewonnenen Stammzellen als eine neuartige Zellquelle für das Tissue-Engineering von Haut-Substituten. Die stromal-vaskuläre-Zellfraktion (SVF) aus dem Fettgewebe ist eine heterogene Zellpopulation die sowohl Mesenchym- als auch Endothelzellen enthält, aber keine reifen Adipozyten mehr. Die hier dargestellte Arbeit zeigt folgende Befunde: Ich beobachtete erstens, dass die Mesenchymal- und Endothelzellen der SVF ein dichtes, miteinander kommunizierendes Kapillar-Netzwerk in Fibrin-Hydrogelen in vitro entwickelt haben [1]. Zweitens konnte ich demonstrieren, dass die menschlichen engineerten Kapillaren bereits in vitro durch perivaskuläre Zellen (Perizyten) stabilisiert wurden. Dies wurde durch eine Färbung mit Perizyt-spezifischen Markern wie α-Aktin der glatten Muskeln (αSMA) oder Neuron-Glia-Antigen 2 (NG2) nachgewiesen. Nach der Transplantation auf immuno-inkompetente Ratten schlossen sich diese Kapillarnetzwerke in den prä-vaskularisierten Haut-Substituten an die Ratten-Blutgefässe innerhalb von 3-4 Tagen an (Inoskulation). Im Gegensatz dazu war das Einwachsen von Ratten-Blutgefässen in die nicht prä-vaskularisierten Kontroll-Substitute verzögert. Die Blutperfusion der gesamten Dermis wurde in vivo erst nach dem 14. Tag beobachtet. Im Übrigen untersuchte ich die Effekte der schnellen Blutperfusion der prä-vaskularisierten Haut-Substitute auf die epidermale und dermale Hautregeneration in vivo. Die prä- vaskularisierten Substitute zeigten in vivo eine grössere Fläche und eine verstärkte Kollagen Typ I-Ablagerung in der Dermis. Weiterhin analysierte ich die Expression von Homöostase- und Wundheilungs-Markern in der Epidermis. Die Färbung für Zytokeratine 16 und 17 ergab, dass die Wundheilungsperiode in den prä-vaskularisierten Haut-Substituten drastisch verringert war. Darüber hinaus zeigte eine verminderte Expression von Zytokeratin 19 in den Keratinozyten der Basalschicht, dass die Prä-Vaskularisierung ebenfalls zu einer schnelleren epidermalen Homöostase beitrug. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich verschiedene Merkmale der tissue-engineerten Haut-Substitute in Hinblick auf unsere zukünftige klinische Anwendung untersucht.
Diesbezüglich habe ich das Protokoll zur Herstellung unserer Haut-Substitute soweit optimiert, dass deren Produktion von 21 auf 12 Tage reduziert werden konnte [2]. Ich habe auch untersucht, ob es möglich ist, in unseren Haut-Substituten Pigment produzierende Zellen, sogenannte Melanozyten, in die Epidermis zu integrieren [3]. Ein wichtiger Teil dieser Studie war es die Funktion und das Verhalten der Melanozyten, sowie ihre Interaktionen mit den Keratinozyten in kurz- und langfristigen in vivo Versuchen, zu beobachten. Zudem wurden in diesen Substituten die Innervierung und das Einwachsen von Blut- und Lymphgefässen systematisch untersucht [4-5].

Abstract

Survival of cells within a transplanted skin substitute is dependent on the diffusion of nutrients and oxygen from the underlying wound site. Thus, formation of mature capillary networks in vitro in the skin substitute, so called prevascularization, is a promising approach to overcome this limitation. For this purpose I investigated human adipose-derived stem cells as a novel cell source for the tissue-engineering of prevascularized skin substitutes. The so called stromal-vascular fraction (SVF) isolated from adipose tissue is a heterogeneous cell population including mesenchymal and endothelial cells but is depleted from mature adipocytes. I observed that both endothelial and mesenchymal cells present in the SVF assembled into a dense, microvascular network when submerged within fibrin hydrogels [1]. I also found that human tissue-engineered capillaries were already stabilized in vitro by perivascular cells (pericytes) as illustrated by a staining for pericyte specific markers such as α-smooth muscle actin (αSMA) and neuron-glial antigen 2 (NG2). Most importantly, I demonstrated that SVF-derived capillary networks present in the prevascularized skin substitutes had the potential to connect to the host vasculature (by inosculation) within 3-4 days after transplantation onto the backs of immuno-incompetent rats. In contrast, transplantation of non-prevascularized controls, lacking endothelial cells, resulted in a delayed ingrowth of rat vessels and graft perfusion, which was not observed before day 14 after transplantation. Moreover, I examined the effects associated with rapid graft perfusion in vivo regarding the regeneration of the dermal and epidermal skin compartment. Skin substitutes prevascularized by cells of the SVF demonstrated an increased graft size after transplantation, as well as an enhanced collagen type I deposition in the dermal compartment. Furthermore, I evaluated the expression of tissue homeostasis and wound healing markers in the epidermis. The staining for cytokeratin 16 and 17 (wound healing markers) revealed that the period of wound healing could be dramatically decreased in the prevascularized skin grafts. Expression of cytokeratin 19 (skin homeostasis marker) restricted to the basal keratinocyte layer rather than also expressed in several suprabasal layers, demonstrated that graft prevascularization contributed to a faster epidermal homeostasis. In the second part of my work, I have characterized different features of tissue- engineered skin substitutes regarding our future clinical trial. In this regard, I was able to contribute to the optimization of the protocol for the production of skin substitutes to shorten their total culture time from 21 to 12 days [2].
Das Überleben der Zellen innerhalb eines transplantierten Haut-Substituts ist abhängig von adäquater Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff, Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Hormonen ausgehend vom darunter liegenden Wundbett. Deshalb ist die Bildung reifer Kapillarnetzwerke in vitro in dem Haut-Substitut (eine sogenannte Prä-Vaskularisierung) ein viel versprechender Ansatz, um diese Einschränkung zu überwinden. Zu diesem Zweck untersuchte ich die aus menschlichem Fettgewebe gewonnenen Stammzellen als eine neuartige Zellquelle für das Tissue-Engineering von Haut-Substituten. Die stromal-vaskuläre-Zellfraktion (SVF) aus dem Fettgewebe ist eine heterogene Zellpopulation die sowohl Mesenchym- als auch Endothelzellen enthält, aber keine reifen Adipozyten mehr. Die hier dargestellte Arbeit zeigt folgende Befunde: Ich beobachtete erstens, dass die Mesenchymal- und Endothelzellen der SVF ein dichtes, miteinander kommunizierendes Kapillar-Netzwerk in Fibrin-Hydrogelen in vitro entwickelt haben [1]. Zweitens konnte ich demonstrieren, dass die menschlichen engineerten Kapillaren bereits in vitro durch perivaskuläre Zellen (Perizyten) stabilisiert wurden. Dies wurde durch eine Färbung mit Perizyt-spezifischen Markern wie α-Aktin der glatten Muskeln (αSMA) oder Neuron-Glia-Antigen 2 (NG2) nachgewiesen. Nach der Transplantation auf immuno-inkompetente Ratten schlossen sich diese Kapillarnetzwerke in den prä-vaskularisierten Haut-Substituten an die Ratten-Blutgefässe innerhalb von 3-4 Tagen an (Inoskulation). Im Gegensatz dazu war das Einwachsen von Ratten-Blutgefässen in die nicht prä-vaskularisierten Kontroll-Substitute verzögert. Die Blutperfusion der gesamten Dermis wurde in vivo erst nach dem 14. Tag beobachtet. Im Übrigen untersuchte ich die Effekte der schnellen Blutperfusion der prä-vaskularisierten Haut-Substitute auf die epidermale und dermale Hautregeneration in vivo. Die prä- vaskularisierten Substitute zeigten in vivo eine grössere Fläche und eine verstärkte Kollagen Typ I-Ablagerung in der Dermis. Weiterhin analysierte ich die Expression von Homöostase- und Wundheilungs-Markern in der Epidermis. Die Färbung für Zytokeratine 16 und 17 ergab, dass die Wundheilungsperiode in den prä-vaskularisierten Haut-Substituten drastisch verringert war. Darüber hinaus zeigte eine verminderte Expression von Zytokeratin 19 in den Keratinozyten der Basalschicht, dass die Prä-Vaskularisierung ebenfalls zu einer schnelleren epidermalen Homöostase beitrug. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich verschiedene Merkmale der tissue-engineerten Haut-Substitute in Hinblick auf unsere zukünftige klinische Anwendung untersucht.
Diesbezüglich habe ich das Protokoll zur Herstellung unserer Haut-Substitute soweit optimiert, dass deren Produktion von 21 auf 12 Tage reduziert werden konnte [2]. Ich habe auch untersucht, ob es möglich ist, in unseren Haut-Substituten Pigment produzierende Zellen, sogenannte Melanozyten, in die Epidermis zu integrieren [3]. Ein wichtiger Teil dieser Studie war es die Funktion und das Verhalten der Melanozyten, sowie ihre Interaktionen mit den Keratinozyten in kurz- und langfristigen in vivo Versuchen, zu beobachten. Zudem wurden in diesen Substituten die Innervierung und das Einwachsen von Blut- und Lymphgefässen systematisch untersucht [4-5].

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Schäfer Beat Werner, Sommer Lukas
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2014
Deposited On:04 Apr 2019 06:21
Last Modified:25 Sep 2019 00:14
Number of Pages:151
OA Status:Green
Related URLs:https://www.recherche-portal.ch/primo-explore/fulldisplay?docid=ebi01_prod010335333&context=L&vid=ZAD&search_scope=default_scope&tab=default_tab&lang=de_DE (Library Catalogue)

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