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Dissecting the role of Parp1/Artd1, Sox2 and Fgf4 during reprogramming


Weber, Fabienne. Dissecting the role of Parp1/Artd1, Sox2 and Fgf4 during reprogramming. 2014, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Abstract The ground‐breaking discovery of Takahashi and Yamanaka provided evidence that forced expression of four transcription factors, Oct4, Sox2, Klf4 and c‐Myc, can reprogram mouse somatic cells to plu‐ ripotent stem cells, also known as induced pluripotent stem cells (iPSCs). Similar to embryonic stem cells (ESCs), iPSCs have the ability on one hand to permanently self‐renew and on the other hand to differentiate into any cell type of the body. Thus, these cells offer great potential to develop disease models in vitro, drug and toxicity screening tools as well as patient‐derived iPSCs for future clinical applications. Regarding these characteristics, it is not surprising that in the past years a variety of reprogramming methods have been developed. However, most of these approaches coincide with low reprogramming efficiency, the genomic integration of the reprogramming factors and a long duration of the reprogramming process. In addition, the understanding of the underlying molecular mechanisms is still limited. Therefore, increasing the knowledge of the processes that orchestrate the reprogramming process is crucial for the establishment of more efficient reprogramming tech‐ niques and the generation of high‐quality iPSCs. The key aim of this thesis was to gain knowledge of the molecular mechanisms driving the repro‐ gramming process, in particular the role of Artd1, Sox2 and Fgf4 in the early phase of the repro‐ gramming process. Artd1/Parp1 is an abundant nuclear DNA‐binding protein that catalyses the covalent attachment of poly(ADP‐ribose) (PAR) to itself and to other nuclear acceptor proteins. ADP‐ribosylation plays an important role in numerous biological processes, including maintenance of genomic integrity, cell death and transcriptional regulation. The transcription factor Sox2 is a key player in the transcrip‐ tional network maintaining the pluripotent state of ESCs. Moreover, it is one of the four factors that initiate the reprogramming process. The two proteins Artd1 and Sox2 have already been shown to cooperatively regulate the expression of Fgf4 in ESCs. Fgf4 in turn is typically expressed in pluripotent stem cells such as ESCs and iPSCs. Furthermore, it is involved in the control of pluripotency and line‐ age specification of ESCs. Thus, we aimed to investigate the potential function of Artd1, Sox2 and Fgf4 during the reprogramming process. In an initial experiment we show that absence of Artd1 or inhibition of its enzymatic activity significantly reduces the reprogramming efficiency of mouse fibro‐ blasts. A subsequent time‐course experiment reveals that a functional enzymatic activity of Artd1 is essential during the first days of the reprogramming process in particular. We can show that in this early phase of reprogramming Artd1 interacts with and PARylates Sox2. As Artd1 and Sox2 have been demonstrated to regulate the expression of Fgf4 in ESCs, we wondered whether the Sox2‐Artd1 complex holds a similar role during reprogramming. By analysing the expression level of Fgf4 in wild‐ type cells, Artd1‐deficient fibroblasts and PARP‐inhibitor treated wild‐type fibroblasts and subse‐ quent chromatin immunoprecipitation against Sox2, we demonstrate that ADP‐ribosylation of Sox2 strengthens its binding to the Fgf4 enhancer, thereby stimulating the transcription of Fgf4. The find‐ ing that inhibition of the Fgf receptor tyrosine kinase activity significantly reduced the reprogram‐ ming efficiency highlights the importance of functional Fgf4. Thus, we aimed to understand the mechanism by which Fgf4 modulates the reprogramming process. Our data illustrate that addition of exogenous Fgf4 during reprogramming induces an increase in the number of iPSC colonies and that inhibition of FGF‐signalling negatively affects the reprogramming efficiency. This effect is most signif‐ icant when blocking FGF‐signalling between d4 and d8 of the reprogramming process. We finally demonstrate that in this phase of the reprogramming process, Fgf4 regulates cell proliferation and favours mesenchymal‐to‐epithelial transition. Taken together, our work demonstrates that Artd1‐mediated PARylation of Sox2 is essential to posi‐ tively modulate Fgf4 transcription during the reprogramming process. In addition, we identify Fgf4 as an important factor for promoting reprogramming by favouring mesenchymal‐to‐epithelial transi‐ tion. Zusammenfassung Takahashi und Yamanaka machten im Jahre 2006 eine bahnbrechende Entdeckung, welche zeigte, dass die Expression der vier Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c‐Myc ausreicht um somati‐ sche Zellen der Maus in pluripotente Stammzellen umzuwandeln (=umzuprogrammieren). Sie gaben diese Zellen den Namen „induzierte pluripotente Stammzellen“ (iPS Zellen). Ähnlich wie embryonale Stammzellen haben auch iPS Zellen die Fähigkeit sich dauerhaft selbst zu erneuern und sich in jede Gewebezelle unseres Körpers zu entwickeln. Dank dieser Eigenschaften weisen diese Zellen ein gros‐ ses Potential auf für die Entwicklung von in vitro Krankheitsmodellen, Drogen‐ und Toxizitätsscree‐ ning‐Tools und Patienten‐spezifischen iPS Zellen für klinische Anwendungen. Das Wissen über das Potential dieser Zellen hat dazu geführt, dass in den letzten Jahren viel Zeit in die Optimierung und Neuentwicklung von Reprogrammierungsmethoden investiert wurde. Dennoch haben die meisten dieser Methoden den Nachteil einer geringen Effizienz, einer langen Prozessdauer und der genomi‐ schen Integration der Reprogrammierungsfaktoren. Erschwerend kommt hinzu, dass das Wissen über die dem Reprogrammierungsprozess zugrunde liegenden molekularen Mechanismen noch immer sehr begrenzt ist. Daher ist es für die Entwicklung von effizienteren Reprogrammierungsmethoden und die Herstellung von hochwertigen iPS Zellen von entscheidender Bedeutung, mehr Kenntnisse über diese molekularen Mechanismen zu gewinnen. Dementsprechend war es das Ziel dieser Arbeit einen vertieften Einblick in die den Reprogrammierungsprozess steuernden molekularen Mechanis‐ men zu erhalten. Es gelang schlussendlich aufzuzeigen, dass Artd1, Sox2 und Fgf4 in der frühen Phase des Reprogrammierungsprozesses eine wichtige Rolle spielen. Das Enzym Artd1/Parp1 katalysiert die kovalente Bindung von Poly(APD‐Ribose) an Akzeptor‐ Proteine und sich selbst im Zellkern. ADP‐Ribosylierung spielt in vielen biologischen Prozesse eine wichtige Rolle, so zum Beispiel bei der Aufrechterhaltung der genomischen Unversehrtheit, beim Zelltod und bei der Regulation der Transkription. Das Protein Sox2 ist ein wichtiger Transkriptionsfak‐ tor für die Erhaltung der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen und gehört zu den vier Faktoren, die den Reprogrammierungsprozess initiieren. Es wurde bereits in embryonalen Stammzellen gezeigt, dass Artd1 und Sox2 gemeinsam die Expression von Fgf4 modulieren. In embryonalen Stammzellen reguliert Fgf4 die Entscheidung zwischen Erhaltung des pluripotenten Status oder Differenzierung zu spezifizierten Zellen. Interessanterweise wurde auch gezeigt, dass Fgf4 nicht nur in embryonalen Stammzellen, sondern auch in iPS Zellen exprimiert wird. Basierend darauf lag unser Interesse darin, die Funktion von Artd1, Sox2 und Fgf4 während des Reprogrammierungsprozesses zu untersuchen. Ein erster Versuch zeigte, dass die Abwesenheit von Artd1 oder die Hemmung der enzymatischen Aktivität von Artd1 die Reprogrammierungseffizienz von Fibroblasten signifikant reduziert. Mit einem nachfolgenden Experiment konnten wir demonstrieren, dass die enzymatische Aktivität von Artd1 nur in den ersten Tagen des Reprogrammierungsprozesses notwendig ist. In dieser frühen Phase des Prozesses interagiert Artd1 einerseits mit Sox2 und ist andererseits für die Poly(ADP‐Ribosylierung) von Sox2 zuständig. Frühere Publikationen zeigten, dass in embryonalen Stammzellen diese Modifi‐ zierung von Sox2 entscheidend für die Expression von Fgf4 ist. Daher haben wir uns die Frage ge‐ stellt, ob der Sox2‐Artd1 Komplex auch während des Reprogrammierungsprozesses die Expression von Fgf4 steuert. Durch eine Expressionsanalyse von Fgf4 und einen Chromatinimmunpräzipitations‐ assay in Wildtypzellen, Artd1‐/‐ Zellen und PARP‐inhibierten Wildtypzellen konnten wir zeigen, dass die Bindung von Sox2 an den Enhancer von Fgf4 durch die ADP‐Ribosylierung begünstigt und ver‐ stärkt wird. Weiter konnten wir aufweisen, dass diese Bindung entscheidend ist für die Aktivierung der Transkription von Fgf4. Basierend auf diesen Resultaten untersuchten wir, ob Fgf4 selbst eine wichtige Rolle im Reprogrammierungsprozess spielt. Es zeigte sich, dass die Inhibierung der Tyrosin‐ Kinase‐Aktivität des Fgf‐Rezeptors zu einer signifikanten Reduktion der Reprogrammierungseffizienz führt. Auf dieser Grundlage entschieden wir uns die Rolle von Fgf4 während des Reprogrammierens näher zu analysieren. Unsere Resultate offenbarten einerseits, dass die exogene Zugabe von Fgf4 während dem Reprogrammierungsprozess zu einer signifikanten Zunahme der iPS Kolonien führt und andererseits, dass sich die Hemmung des FGF‐Signalweges negativ auf die Reprogrammierungseffizi‐ enz auswirkt. Dieser von Fgf4 initiierte Effekt war zwischen dem Tag 4 und Tag 8 am stärksten sicht‐ bar. Weiterführende Experimente demonstrierten schlussendlich, dass Fgf4 einerseits auf die Zell‐ proliferation einwirkt und andererseits die mesenchymal‐epitheliale Transition begünstigt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die durch Artd1 vermittelte PARylierung von Sox2 wich‐ tig ist, um die Transkription von Fgf4 während des Reprogrammierungsprozesses zu fördern. Weiter gelang es uns nachzuweisen, dass Fgf4 die mesenchymal‐epitheliale Transition unterstützt und des‐ halb ein wichtiger Faktor zur Förderung des Reprogrammierungsprozesses ist.

Abstract

Abstract The ground‐breaking discovery of Takahashi and Yamanaka provided evidence that forced expression of four transcription factors, Oct4, Sox2, Klf4 and c‐Myc, can reprogram mouse somatic cells to plu‐ ripotent stem cells, also known as induced pluripotent stem cells (iPSCs). Similar to embryonic stem cells (ESCs), iPSCs have the ability on one hand to permanently self‐renew and on the other hand to differentiate into any cell type of the body. Thus, these cells offer great potential to develop disease models in vitro, drug and toxicity screening tools as well as patient‐derived iPSCs for future clinical applications. Regarding these characteristics, it is not surprising that in the past years a variety of reprogramming methods have been developed. However, most of these approaches coincide with low reprogramming efficiency, the genomic integration of the reprogramming factors and a long duration of the reprogramming process. In addition, the understanding of the underlying molecular mechanisms is still limited. Therefore, increasing the knowledge of the processes that orchestrate the reprogramming process is crucial for the establishment of more efficient reprogramming tech‐ niques and the generation of high‐quality iPSCs. The key aim of this thesis was to gain knowledge of the molecular mechanisms driving the repro‐ gramming process, in particular the role of Artd1, Sox2 and Fgf4 in the early phase of the repro‐ gramming process. Artd1/Parp1 is an abundant nuclear DNA‐binding protein that catalyses the covalent attachment of poly(ADP‐ribose) (PAR) to itself and to other nuclear acceptor proteins. ADP‐ribosylation plays an important role in numerous biological processes, including maintenance of genomic integrity, cell death and transcriptional regulation. The transcription factor Sox2 is a key player in the transcrip‐ tional network maintaining the pluripotent state of ESCs. Moreover, it is one of the four factors that initiate the reprogramming process. The two proteins Artd1 and Sox2 have already been shown to cooperatively regulate the expression of Fgf4 in ESCs. Fgf4 in turn is typically expressed in pluripotent stem cells such as ESCs and iPSCs. Furthermore, it is involved in the control of pluripotency and line‐ age specification of ESCs. Thus, we aimed to investigate the potential function of Artd1, Sox2 and Fgf4 during the reprogramming process. In an initial experiment we show that absence of Artd1 or inhibition of its enzymatic activity significantly reduces the reprogramming efficiency of mouse fibro‐ blasts. A subsequent time‐course experiment reveals that a functional enzymatic activity of Artd1 is essential during the first days of the reprogramming process in particular. We can show that in this early phase of reprogramming Artd1 interacts with and PARylates Sox2. As Artd1 and Sox2 have been demonstrated to regulate the expression of Fgf4 in ESCs, we wondered whether the Sox2‐Artd1 complex holds a similar role during reprogramming. By analysing the expression level of Fgf4 in wild‐ type cells, Artd1‐deficient fibroblasts and PARP‐inhibitor treated wild‐type fibroblasts and subse‐ quent chromatin immunoprecipitation against Sox2, we demonstrate that ADP‐ribosylation of Sox2 strengthens its binding to the Fgf4 enhancer, thereby stimulating the transcription of Fgf4. The find‐ ing that inhibition of the Fgf receptor tyrosine kinase activity significantly reduced the reprogram‐ ming efficiency highlights the importance of functional Fgf4. Thus, we aimed to understand the mechanism by which Fgf4 modulates the reprogramming process. Our data illustrate that addition of exogenous Fgf4 during reprogramming induces an increase in the number of iPSC colonies and that inhibition of FGF‐signalling negatively affects the reprogramming efficiency. This effect is most signif‐ icant when blocking FGF‐signalling between d4 and d8 of the reprogramming process. We finally demonstrate that in this phase of the reprogramming process, Fgf4 regulates cell proliferation and favours mesenchymal‐to‐epithelial transition. Taken together, our work demonstrates that Artd1‐mediated PARylation of Sox2 is essential to posi‐ tively modulate Fgf4 transcription during the reprogramming process. In addition, we identify Fgf4 as an important factor for promoting reprogramming by favouring mesenchymal‐to‐epithelial transi‐ tion. Zusammenfassung Takahashi und Yamanaka machten im Jahre 2006 eine bahnbrechende Entdeckung, welche zeigte, dass die Expression der vier Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c‐Myc ausreicht um somati‐ sche Zellen der Maus in pluripotente Stammzellen umzuwandeln (=umzuprogrammieren). Sie gaben diese Zellen den Namen „induzierte pluripotente Stammzellen“ (iPS Zellen). Ähnlich wie embryonale Stammzellen haben auch iPS Zellen die Fähigkeit sich dauerhaft selbst zu erneuern und sich in jede Gewebezelle unseres Körpers zu entwickeln. Dank dieser Eigenschaften weisen diese Zellen ein gros‐ ses Potential auf für die Entwicklung von in vitro Krankheitsmodellen, Drogen‐ und Toxizitätsscree‐ ning‐Tools und Patienten‐spezifischen iPS Zellen für klinische Anwendungen. Das Wissen über das Potential dieser Zellen hat dazu geführt, dass in den letzten Jahren viel Zeit in die Optimierung und Neuentwicklung von Reprogrammierungsmethoden investiert wurde. Dennoch haben die meisten dieser Methoden den Nachteil einer geringen Effizienz, einer langen Prozessdauer und der genomi‐ schen Integration der Reprogrammierungsfaktoren. Erschwerend kommt hinzu, dass das Wissen über die dem Reprogrammierungsprozess zugrunde liegenden molekularen Mechanismen noch immer sehr begrenzt ist. Daher ist es für die Entwicklung von effizienteren Reprogrammierungsmethoden und die Herstellung von hochwertigen iPS Zellen von entscheidender Bedeutung, mehr Kenntnisse über diese molekularen Mechanismen zu gewinnen. Dementsprechend war es das Ziel dieser Arbeit einen vertieften Einblick in die den Reprogrammierungsprozess steuernden molekularen Mechanis‐ men zu erhalten. Es gelang schlussendlich aufzuzeigen, dass Artd1, Sox2 und Fgf4 in der frühen Phase des Reprogrammierungsprozesses eine wichtige Rolle spielen. Das Enzym Artd1/Parp1 katalysiert die kovalente Bindung von Poly(APD‐Ribose) an Akzeptor‐ Proteine und sich selbst im Zellkern. ADP‐Ribosylierung spielt in vielen biologischen Prozesse eine wichtige Rolle, so zum Beispiel bei der Aufrechterhaltung der genomischen Unversehrtheit, beim Zelltod und bei der Regulation der Transkription. Das Protein Sox2 ist ein wichtiger Transkriptionsfak‐ tor für die Erhaltung der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen und gehört zu den vier Faktoren, die den Reprogrammierungsprozess initiieren. Es wurde bereits in embryonalen Stammzellen gezeigt, dass Artd1 und Sox2 gemeinsam die Expression von Fgf4 modulieren. In embryonalen Stammzellen reguliert Fgf4 die Entscheidung zwischen Erhaltung des pluripotenten Status oder Differenzierung zu spezifizierten Zellen. Interessanterweise wurde auch gezeigt, dass Fgf4 nicht nur in embryonalen Stammzellen, sondern auch in iPS Zellen exprimiert wird. Basierend darauf lag unser Interesse darin, die Funktion von Artd1, Sox2 und Fgf4 während des Reprogrammierungsprozesses zu untersuchen. Ein erster Versuch zeigte, dass die Abwesenheit von Artd1 oder die Hemmung der enzymatischen Aktivität von Artd1 die Reprogrammierungseffizienz von Fibroblasten signifikant reduziert. Mit einem nachfolgenden Experiment konnten wir demonstrieren, dass die enzymatische Aktivität von Artd1 nur in den ersten Tagen des Reprogrammierungsprozesses notwendig ist. In dieser frühen Phase des Prozesses interagiert Artd1 einerseits mit Sox2 und ist andererseits für die Poly(ADP‐Ribosylierung) von Sox2 zuständig. Frühere Publikationen zeigten, dass in embryonalen Stammzellen diese Modifi‐ zierung von Sox2 entscheidend für die Expression von Fgf4 ist. Daher haben wir uns die Frage ge‐ stellt, ob der Sox2‐Artd1 Komplex auch während des Reprogrammierungsprozesses die Expression von Fgf4 steuert. Durch eine Expressionsanalyse von Fgf4 und einen Chromatinimmunpräzipitations‐ assay in Wildtypzellen, Artd1‐/‐ Zellen und PARP‐inhibierten Wildtypzellen konnten wir zeigen, dass die Bindung von Sox2 an den Enhancer von Fgf4 durch die ADP‐Ribosylierung begünstigt und ver‐ stärkt wird. Weiter konnten wir aufweisen, dass diese Bindung entscheidend ist für die Aktivierung der Transkription von Fgf4. Basierend auf diesen Resultaten untersuchten wir, ob Fgf4 selbst eine wichtige Rolle im Reprogrammierungsprozess spielt. Es zeigte sich, dass die Inhibierung der Tyrosin‐ Kinase‐Aktivität des Fgf‐Rezeptors zu einer signifikanten Reduktion der Reprogrammierungseffizienz führt. Auf dieser Grundlage entschieden wir uns die Rolle von Fgf4 während des Reprogrammierens näher zu analysieren. Unsere Resultate offenbarten einerseits, dass die exogene Zugabe von Fgf4 während dem Reprogrammierungsprozess zu einer signifikanten Zunahme der iPS Kolonien führt und andererseits, dass sich die Hemmung des FGF‐Signalweges negativ auf die Reprogrammierungseffizi‐ enz auswirkt. Dieser von Fgf4 initiierte Effekt war zwischen dem Tag 4 und Tag 8 am stärksten sicht‐ bar. Weiterführende Experimente demonstrierten schlussendlich, dass Fgf4 einerseits auf die Zell‐ proliferation einwirkt und andererseits die mesenchymal‐epitheliale Transition begünstigt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die durch Artd1 vermittelte PARylierung von Sox2 wich‐ tig ist, um die Transkription von Fgf4 während des Reprogrammierungsprozesses zu fördern. Weiter gelang es uns nachzuweisen, dass Fgf4 die mesenchymal‐epitheliale Transition unterstützt und des‐ halb ein wichtiger Faktor zur Förderung des Reprogrammierungsprozesses ist.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Lutz Thomas A, Cinelli Paolo
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2014
Deposited On:04 Apr 2019 07:08
Last Modified:15 Apr 2021 15:01
Number of Pages:106
OA Status:Green

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