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Renal-specific and inducible depletion of NaPi-IIc/Slc34a3, the cotransporter mutated in herdeditary hypophosphatemic rickets with hypercalciuria, does not affect phosphate or calcium homeostasis in mice


Myakala, Komuraiah. Renal-specific and inducible depletion of NaPi-IIc/Slc34a3, the cotransporter mutated in herdeditary hypophosphatemic rickets with hypercalciuria, does not affect phosphate or calcium homeostasis in mice. 2014, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Zusammenfassung Die homöostatische Kontrolle von systemischem Phosphat (Pi) wird weitgehend durch die Balance von renaler Reabsorption von Pi aus dem Ultrafiltrat und intestinaler Absorption von Pi aus der Nahrung aufrecht erhalten. Die renale Reabsorption von Pi findet hauptsächlich in den proximalen Tubuli statt wofür die Na/Pi-Kotransporter Slc34a1/NaPi-IIa, Slc34a3/NaPi- IIc und Slc20a2/Pit-2 verantwortlich sind. Diese Transportproteine sind in der apikalen Membran lokalisiert und werden durch verschiedene Hormone reguliert, wie z.B. durch das Parathormon (PTH) oder durch den “fibroblast growth factor 23“ (FGF23). Aufgrund der Daten die von NaPi-IIa und NaPi-IIc defizienten Mausmodellen erhalten wurden geht hervor, dass NaPi-Ila quantitativ die Hauptrolle bei der renalen Reabsorption von Pi spielt, wohingegen NaPi-Ilc eine wohl eher geringere Rolle spielt und eventuell auf junge Tiere beschränkt ist. Im Gegensatz zu der Maus, wurden beim Menschen verschiedene Mutationen im NaPi-IIc Gen beschrieben, welche mit dem Krankheitsbild HHRH (hereditary hypophosphatemic rickets with hypercalciurie) assoziert sind.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es ein Mausmodell zu generieren, in welchem das NaPi- llc Gen nierenspezifisch und induzierbar ausgeschaltet werden kann. Dieses Modell basiert auf dem loxP:Cre Rekombinase-System. Transgene Mäuse, welche homozygote Träger des gefloxten NaPi-Ilc (NaPi-IIcf/f) Gens waren, wurden mit Pax8rtTA/LC1 Tieren verpaart. Damit wurden Mäuse erhalten in denen die Expression der Cre-Rekombinase nierenspezifisch durch Doxycyclin (Doxy) induziert werden konnte.
Zu Beginn der Experimente wurde die Cre Aktivität in 3 bis 4 Wochen alten Mäusen durch die Gabe von 2 mg/ml Doxy im Trinkwasser während 10 Tagen induziert. Als Negativkontrollen dienten Wurfgeschwister. Urinproben wurden während den letzten 24 Stunden des Versuchsprotokolls gesammelt und am Ende wurden Blut, Nieren und Ileum entnommen. Diese Behandlung führte zu einer kompletten Reduktion von NaPi-llc mRNA und Protein in den Nieren. Allerdings war die Ausscheidung von Pi im Urin bei allen Doxy behandelten Tieren erhöht, mit gleichzeitiger reduzierter Ausscheidung von Na + - und K+ - Ionen. Dies deutete darauf hin, dass die Behandlung mit 2 mg/ml Doxy entweder zu unspezifischen renalen Effekten führte, oder möglicherweise eine intestinale Veränderung bewirkte.
Um die Dosierung von Doxy zu optimieren wurden NaPi-IIc+/+ und NaPi-IIcf/f Mäuse zunächst während 10 Tagen entweder mit 1, 0.5 oder 0.25 mg/ml Doxy behandelt, gefolgt von einer Erholungsperiode von 15 Tagen mit normalem Trinkwasser. Bei Tieren, die 1 respektive 0.5 mg/ml Doxy erhielten war die Ausscheidung von Na+ -Ionen im Urin immer noch reduziert, aber nicht mehr in Mäusen die mit 0.25 mg/ml behandelt wurden. In NaPi-IIcf/f Mäusen wurde die Expression von NaPi-IIc mRNA durch die Gabe von 1 respektive 0.5 mg/ml Doxy beinahe komplett unterdrückt, wohingegen 25% der Expression der NaPi-llc mRNA nach einer Dosis von 0.25 mg/ml erhalten blieben. Aufgrund dieser Resultate wurde ein neues Doxy Dosierungsprotokoll erarbeitet, nach dem die Tiere zunächst für 5 Tage mit 0.5 mg/ml Doxy und anschliessend für weitere 5 Tage mit 0.25 mg/ml Doxy behandelt wurden. Nach einer 15-tägigen Erholungsphase wurden die Tiere erneut untersucht. Als Indikator für unspezifische Effekte wurde wieder die Konzentration von Na+ -Ionen im Urin gemessen. Die Ausscheidung von Na+-Ionen im Urin bei behandelten Tieren war vergleichbar zu den Kontrollen, was darauf schliessen liess, dass dieses Induktionsprotokoll keine unspezifischen renalen Effekte hervorrufte. Die folgenden Experimente wurden deshalb mit diesem optimierten Protokoll durchgeführt.
Die Expression von NaPi-IIc mRNA und NaPi-llc Protein waren vergleichbar in NaPi-IIc+/+ Kontrollmäusen die entweder mit Doxy oder nur mit Saccharose im Trinkwasser behandelt wurden. Erwartungsgemäss führte die Behandlung mit Doxy zu einer 50%-igen beziehungsweise 90%-igen Reduktion der Menge von NaPi-llc mRNA und Protein in NaPi- IIcf/+ und NaPi-IIcf/f Tieren. Allerdings hatte das Fehlen von NaPi-Ilc in den Nieren der NaPi- IIcf/f Mäusen keinen Effekt auf die Na/Pi-Kotransport Aktivität in isolierten renalen Bürstensaummembranen und es wurden auch keine Aenderungen der Mengen der anderen renalen Na/Pi-Kotransporter, NaPi-Ila und Pit-2 beobachtet. Ebenso blieb die Menge von NaPi-Ilb in Enterozyten unverändert. Dies deutete darauf hin dass keine Kompensation durch andere Na/Pi-Kotransporter in NaPi-Ilc defizienten Mäusen stattfindet. In Mäusen mit NaPi-IIc defizienten Nieren waren die Ausscheidung von Pi im Urin und die Plasmakonzentration von Pi normal. Die Konzentrationen der phosphaturischen Hormone PTH und FGF23 waren unverändert. Die Konzentrationen von Ca2+ im Plasma und Urin sowie des zirkulierenden 1,25(OH)2D3 waren ebenfalls unverändert. Die Expression der 1α- Hydroxylase und der 24-Hydroxylase mRNA waren vergleichbar in NaPi-IIc+/+ und NaPi-IIcf/f Mäusen.
Die Daten, die mit den induzierbaren nierenspezifischen NaPi-IIc defizienten Mäusen erhalten wurden, sind nur teilweise übereinstimmend mit den Beobachtungen, die für konstitutiv NaPi-IIc defiziente Mäuse beschrieben wurden. Obwohl in konstitutiv NaPi-IIc defizienten Mäusen die Pi Ausscheidung im Urin und die Plasmakonzentration von Pi ebenso normal blieben, ging die konstitutive Defizienz von NaPi-IIc mit einer Hyperkalzämie und Hyperkalziurie, sowie einer erhöhten Konzentration von 1,25(OH)2D3 einher. Dies lässt darauf schliessen, dass nach einer konstitutiven Deletion des NaPi-llc Gens, das Fehlen von NaPi-IIc in extrarenalen Geweben zu den beobachteten Änderungen des Calcium-Haushaltes führt.
Zusammengefasst haben wir ein Maussmodell generiert, bei welchem das Na/Pi- Kotransporter NaPi-llc Gen SLC34a3 nierenspezifische und induzierbar inaktiviert werden kann. Die Analyse dieses Mausmodells zeigte, dass im Gegensatz zum Menschen, die renale Reabsorption von Pi durch NaPi-IIc minimal ist. Das hier beschriebene neue Mausmodell (floxed NaPi-IIc) erlaubt es, die noch weitgehend unbekannte Rolle von NaPi-IIc in verschiedenen Organen neben der Niere zu untersuchen. Summary Homeostatic control of inorganic phosphate (Pi) is largely achieved by renal reabsorption and intestinal absorption of Pi. Renal reabsorption of Pi takes place preferentially in the proximal tubules and is mediated by the Na/Pi-cotransporters Slc34a1/NaPi-IIa, Slc34a3/NaPi-IIc and Slc20a2/Pit-2. The abundance of these cotransporters is regulated by several hormones including parathyroid hormone (PTH) and fibroblast growth factor23 (FGF23). Based on constitutively deficient NaPi-IIa and NaPi-IIc mouse models, it has been postulated that NaPi-IIa plays a major quantitative role in the renal reabsorption of Pi in rodents, whereas the contribution of NaPi-IIc is considered to be less important and probably restricted to young animals. However, in humans several mutations have been identified in the NaPi-IIc gene that cause hereditary hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH).
The aim of this study was to generate a renal-specific and inducible mouse model deficient of NaPi-IIc to investigate the contribution of this cotransporter to Pi reabsorption in young animals. This model is based on the loxP: Cre recombinase system. Mice harboring both floxed-NaPi-IIc alleles (NaPi-IIcf/f) were bred with Pax8rtTA/LC1 mice in which the renal- specific expression of Cre-recombinase can be induced by doxycycline (Doxy). Further mating resulted in homozygous (NaPi-IIcf/f) and heterozygous mutants (NaPi-IIcf/+) as well as wild type (NaPi-IIc+/+) mice that also expressed Pax8 and Cre.
Initially, Cre activity was induced in 3 to 4 weeks old mice by providing them water supplemented with 2 mg/ml Doxy in 2% sucrose for 10 days; as negative control, littermates drank 2% sucrose. Urinary samples were collected during the last 24 hours and at the end of the experimental protocol blood, kidney and ileum were extracted. The treatment with Doxy led to no changes in the expression of NaPi-IIc mRNA and protein in NaPi-IIc+/+ mice. However, it resulted in a 50% reduction of the cotransporter mRNA and protein in NaPi-IIcf/+ animals and almost full depletion in NaPi-IIcf/f mice compared to sucrose treated controls. Notably, the urinary excretion of Pi was increased in both NaPi-IIc+/+ and NaPi-IIcf/f Doxy treated mice, whereas excretions of Na+ and K+ were reduced in all the groups of mice treated with Doxy compared to controls. These findings suggested that the treatment with 2 mg/ml Doxy produced some non-specific effects, either in the kidney or secondary to intestinal changes possibly due to effects on the gut flora.
Hence, in order to optimize the dosage of Doxy, NaPi-IIc+/+ and NaPi-IIcf/f mice were treated with 1, 0.5 or 0.25 mg/ml Doxy for 10 days, followed by a recovery period of 15 days during which mice drank normal tap water. The excretion of Na+ was still reduced in NaPi-IIc+/+ mice that received 1 and 0.5 mg/ml Doxy, but not in mice subjected to 0.25 mg/ml. In NaPi-IIcf/f mice, the mRNA expression of NaPi-IIc was almost completely depleted upon 1 and 0.5 mg/ml Doxy induction, but 25% of mRNA still remained at the dosage of 0.25 mg/ml. Therefore, we setup a final Doxy treatment protocol consisting of 5 days administration of 0.5 mg/ml Doxy followed by 5 days with 0.25 mg/ml Doxy and a final recovery period of 15 days during which mice received normal drinking water. At the end of the protocol, we measured the concentration of Na+ in urine as an indicator for non-specific effects. The excretion of Na+ was comparable in all the groups of mice treated with either Doxy or sucrose, indicating that the final induction protocol did not produce non-specific effects. All subsequent experiments were performed with this optimized protocol.
The expression of NaPi-IIc mRNA and protein was comparable in NaPi-IIc+/+ mice drinking Doxy or sucrose, whereas the Doxy treatment reduced by 50% and 90% the expression of the cotransporter mRNA and protein in NaPi-IIcf/+ and NaPi-IIcf/f animals, respectively. The absence of NaPi-IIc in the kidneys of NaPi-IIcf/f mice did not affect the Na/Pi-cotransport activity in renal brush border membrane vesicles (BBMVs). Moreover, the expression of other renal Na/Pi-cotransporters, namely NaPi-IIa and Pit-2, remained unaffected. Similarly, the abundance of NaPi-IIb in intestinal BBM did not changed upon removal of NaPi-IIc. This suggests the absence of compensatory changes of other Na/Pi-cotransporters in NaPi-IIc depleted mice.
The urinary excretion of Pi and the concentration of Pi in plasma were normal upon depletion of NaPi-IIc in the kidney. Moreover, the circulating levels of the phosphaturic hormones PTH and FGF23 remained unchanged. The concentration of Ca 2+ in plasma and urine as well as circulating levels of 1,25(OH)2D3 also remained unchanged. Furthermore, the mRNA expression of the 1α-hydroxylase and 24-hydroxylase were comparable in NaPi-IIc+/+ and NaPi-IIcf/f mice.
The data that we obtained with the renal-specific and inducible NaPi-IIc deficient mice are only partially in agreement with observations reported in constitutive NaPi-IIc deficient mice. Thus, in constitutive NaPi-IIc depleted mice the urinary excretion and plasma Pi are normal, similar to our renal-specific model. However, the constitutive depletion of NaPi-IIc resulted in hypercalcemia and hypercalciuria as well as in increased 1,25(OH)2D3. Together these findings suggested that depletion of NaPi-IIc in some extra-renal tissues might explain the changes in Ca2+ homeostasis in the constitutive NaPi-IIc knockouts. Moreover, the absence of changes in Pi and Pi-related parameters in both the constitutive and renal- specific NaPi-IIc deficient models suggests that unlike in humans, NaPi-IIc has a minor role in the renal reabsorption of Pi in mice.
In conclusion, we have generated a renal-specific and inducible NaPi-IIc deficient mouse model. This study indicated that unlike in humans, the reabsorption of Pi by NaPi-IIc is minimal in mouse kidney. The inducible system (floxed NaPi-IIc: Cre recombinase) will allow us to further investigate the role of NaPi-IIc in different organs other than in the kidney.

Abstract

Zusammenfassung Die homöostatische Kontrolle von systemischem Phosphat (Pi) wird weitgehend durch die Balance von renaler Reabsorption von Pi aus dem Ultrafiltrat und intestinaler Absorption von Pi aus der Nahrung aufrecht erhalten. Die renale Reabsorption von Pi findet hauptsächlich in den proximalen Tubuli statt wofür die Na/Pi-Kotransporter Slc34a1/NaPi-IIa, Slc34a3/NaPi- IIc und Slc20a2/Pit-2 verantwortlich sind. Diese Transportproteine sind in der apikalen Membran lokalisiert und werden durch verschiedene Hormone reguliert, wie z.B. durch das Parathormon (PTH) oder durch den “fibroblast growth factor 23“ (FGF23). Aufgrund der Daten die von NaPi-IIa und NaPi-IIc defizienten Mausmodellen erhalten wurden geht hervor, dass NaPi-Ila quantitativ die Hauptrolle bei der renalen Reabsorption von Pi spielt, wohingegen NaPi-Ilc eine wohl eher geringere Rolle spielt und eventuell auf junge Tiere beschränkt ist. Im Gegensatz zu der Maus, wurden beim Menschen verschiedene Mutationen im NaPi-IIc Gen beschrieben, welche mit dem Krankheitsbild HHRH (hereditary hypophosphatemic rickets with hypercalciurie) assoziert sind.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es ein Mausmodell zu generieren, in welchem das NaPi- llc Gen nierenspezifisch und induzierbar ausgeschaltet werden kann. Dieses Modell basiert auf dem loxP:Cre Rekombinase-System. Transgene Mäuse, welche homozygote Träger des gefloxten NaPi-Ilc (NaPi-IIcf/f) Gens waren, wurden mit Pax8rtTA/LC1 Tieren verpaart. Damit wurden Mäuse erhalten in denen die Expression der Cre-Rekombinase nierenspezifisch durch Doxycyclin (Doxy) induziert werden konnte.
Zu Beginn der Experimente wurde die Cre Aktivität in 3 bis 4 Wochen alten Mäusen durch die Gabe von 2 mg/ml Doxy im Trinkwasser während 10 Tagen induziert. Als Negativkontrollen dienten Wurfgeschwister. Urinproben wurden während den letzten 24 Stunden des Versuchsprotokolls gesammelt und am Ende wurden Blut, Nieren und Ileum entnommen. Diese Behandlung führte zu einer kompletten Reduktion von NaPi-llc mRNA und Protein in den Nieren. Allerdings war die Ausscheidung von Pi im Urin bei allen Doxy behandelten Tieren erhöht, mit gleichzeitiger reduzierter Ausscheidung von Na + - und K+ - Ionen. Dies deutete darauf hin, dass die Behandlung mit 2 mg/ml Doxy entweder zu unspezifischen renalen Effekten führte, oder möglicherweise eine intestinale Veränderung bewirkte.
Um die Dosierung von Doxy zu optimieren wurden NaPi-IIc+/+ und NaPi-IIcf/f Mäuse zunächst während 10 Tagen entweder mit 1, 0.5 oder 0.25 mg/ml Doxy behandelt, gefolgt von einer Erholungsperiode von 15 Tagen mit normalem Trinkwasser. Bei Tieren, die 1 respektive 0.5 mg/ml Doxy erhielten war die Ausscheidung von Na+ -Ionen im Urin immer noch reduziert, aber nicht mehr in Mäusen die mit 0.25 mg/ml behandelt wurden. In NaPi-IIcf/f Mäusen wurde die Expression von NaPi-IIc mRNA durch die Gabe von 1 respektive 0.5 mg/ml Doxy beinahe komplett unterdrückt, wohingegen 25% der Expression der NaPi-llc mRNA nach einer Dosis von 0.25 mg/ml erhalten blieben. Aufgrund dieser Resultate wurde ein neues Doxy Dosierungsprotokoll erarbeitet, nach dem die Tiere zunächst für 5 Tage mit 0.5 mg/ml Doxy und anschliessend für weitere 5 Tage mit 0.25 mg/ml Doxy behandelt wurden. Nach einer 15-tägigen Erholungsphase wurden die Tiere erneut untersucht. Als Indikator für unspezifische Effekte wurde wieder die Konzentration von Na+ -Ionen im Urin gemessen. Die Ausscheidung von Na+-Ionen im Urin bei behandelten Tieren war vergleichbar zu den Kontrollen, was darauf schliessen liess, dass dieses Induktionsprotokoll keine unspezifischen renalen Effekte hervorrufte. Die folgenden Experimente wurden deshalb mit diesem optimierten Protokoll durchgeführt.
Die Expression von NaPi-IIc mRNA und NaPi-llc Protein waren vergleichbar in NaPi-IIc+/+ Kontrollmäusen die entweder mit Doxy oder nur mit Saccharose im Trinkwasser behandelt wurden. Erwartungsgemäss führte die Behandlung mit Doxy zu einer 50%-igen beziehungsweise 90%-igen Reduktion der Menge von NaPi-llc mRNA und Protein in NaPi- IIcf/+ und NaPi-IIcf/f Tieren. Allerdings hatte das Fehlen von NaPi-Ilc in den Nieren der NaPi- IIcf/f Mäusen keinen Effekt auf die Na/Pi-Kotransport Aktivität in isolierten renalen Bürstensaummembranen und es wurden auch keine Aenderungen der Mengen der anderen renalen Na/Pi-Kotransporter, NaPi-Ila und Pit-2 beobachtet. Ebenso blieb die Menge von NaPi-Ilb in Enterozyten unverändert. Dies deutete darauf hin dass keine Kompensation durch andere Na/Pi-Kotransporter in NaPi-Ilc defizienten Mäusen stattfindet. In Mäusen mit NaPi-IIc defizienten Nieren waren die Ausscheidung von Pi im Urin und die Plasmakonzentration von Pi normal. Die Konzentrationen der phosphaturischen Hormone PTH und FGF23 waren unverändert. Die Konzentrationen von Ca2+ im Plasma und Urin sowie des zirkulierenden 1,25(OH)2D3 waren ebenfalls unverändert. Die Expression der 1α- Hydroxylase und der 24-Hydroxylase mRNA waren vergleichbar in NaPi-IIc+/+ und NaPi-IIcf/f Mäusen.
Die Daten, die mit den induzierbaren nierenspezifischen NaPi-IIc defizienten Mäusen erhalten wurden, sind nur teilweise übereinstimmend mit den Beobachtungen, die für konstitutiv NaPi-IIc defiziente Mäuse beschrieben wurden. Obwohl in konstitutiv NaPi-IIc defizienten Mäusen die Pi Ausscheidung im Urin und die Plasmakonzentration von Pi ebenso normal blieben, ging die konstitutive Defizienz von NaPi-IIc mit einer Hyperkalzämie und Hyperkalziurie, sowie einer erhöhten Konzentration von 1,25(OH)2D3 einher. Dies lässt darauf schliessen, dass nach einer konstitutiven Deletion des NaPi-llc Gens, das Fehlen von NaPi-IIc in extrarenalen Geweben zu den beobachteten Änderungen des Calcium-Haushaltes führt.
Zusammengefasst haben wir ein Maussmodell generiert, bei welchem das Na/Pi- Kotransporter NaPi-llc Gen SLC34a3 nierenspezifische und induzierbar inaktiviert werden kann. Die Analyse dieses Mausmodells zeigte, dass im Gegensatz zum Menschen, die renale Reabsorption von Pi durch NaPi-IIc minimal ist. Das hier beschriebene neue Mausmodell (floxed NaPi-IIc) erlaubt es, die noch weitgehend unbekannte Rolle von NaPi-IIc in verschiedenen Organen neben der Niere zu untersuchen. Summary Homeostatic control of inorganic phosphate (Pi) is largely achieved by renal reabsorption and intestinal absorption of Pi. Renal reabsorption of Pi takes place preferentially in the proximal tubules and is mediated by the Na/Pi-cotransporters Slc34a1/NaPi-IIa, Slc34a3/NaPi-IIc and Slc20a2/Pit-2. The abundance of these cotransporters is regulated by several hormones including parathyroid hormone (PTH) and fibroblast growth factor23 (FGF23). Based on constitutively deficient NaPi-IIa and NaPi-IIc mouse models, it has been postulated that NaPi-IIa plays a major quantitative role in the renal reabsorption of Pi in rodents, whereas the contribution of NaPi-IIc is considered to be less important and probably restricted to young animals. However, in humans several mutations have been identified in the NaPi-IIc gene that cause hereditary hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH).
The aim of this study was to generate a renal-specific and inducible mouse model deficient of NaPi-IIc to investigate the contribution of this cotransporter to Pi reabsorption in young animals. This model is based on the loxP: Cre recombinase system. Mice harboring both floxed-NaPi-IIc alleles (NaPi-IIcf/f) were bred with Pax8rtTA/LC1 mice in which the renal- specific expression of Cre-recombinase can be induced by doxycycline (Doxy). Further mating resulted in homozygous (NaPi-IIcf/f) and heterozygous mutants (NaPi-IIcf/+) as well as wild type (NaPi-IIc+/+) mice that also expressed Pax8 and Cre.
Initially, Cre activity was induced in 3 to 4 weeks old mice by providing them water supplemented with 2 mg/ml Doxy in 2% sucrose for 10 days; as negative control, littermates drank 2% sucrose. Urinary samples were collected during the last 24 hours and at the end of the experimental protocol blood, kidney and ileum were extracted. The treatment with Doxy led to no changes in the expression of NaPi-IIc mRNA and protein in NaPi-IIc+/+ mice. However, it resulted in a 50% reduction of the cotransporter mRNA and protein in NaPi-IIcf/+ animals and almost full depletion in NaPi-IIcf/f mice compared to sucrose treated controls. Notably, the urinary excretion of Pi was increased in both NaPi-IIc+/+ and NaPi-IIcf/f Doxy treated mice, whereas excretions of Na+ and K+ were reduced in all the groups of mice treated with Doxy compared to controls. These findings suggested that the treatment with 2 mg/ml Doxy produced some non-specific effects, either in the kidney or secondary to intestinal changes possibly due to effects on the gut flora.
Hence, in order to optimize the dosage of Doxy, NaPi-IIc+/+ and NaPi-IIcf/f mice were treated with 1, 0.5 or 0.25 mg/ml Doxy for 10 days, followed by a recovery period of 15 days during which mice drank normal tap water. The excretion of Na+ was still reduced in NaPi-IIc+/+ mice that received 1 and 0.5 mg/ml Doxy, but not in mice subjected to 0.25 mg/ml. In NaPi-IIcf/f mice, the mRNA expression of NaPi-IIc was almost completely depleted upon 1 and 0.5 mg/ml Doxy induction, but 25% of mRNA still remained at the dosage of 0.25 mg/ml. Therefore, we setup a final Doxy treatment protocol consisting of 5 days administration of 0.5 mg/ml Doxy followed by 5 days with 0.25 mg/ml Doxy and a final recovery period of 15 days during which mice received normal drinking water. At the end of the protocol, we measured the concentration of Na+ in urine as an indicator for non-specific effects. The excretion of Na+ was comparable in all the groups of mice treated with either Doxy or sucrose, indicating that the final induction protocol did not produce non-specific effects. All subsequent experiments were performed with this optimized protocol.
The expression of NaPi-IIc mRNA and protein was comparable in NaPi-IIc+/+ mice drinking Doxy or sucrose, whereas the Doxy treatment reduced by 50% and 90% the expression of the cotransporter mRNA and protein in NaPi-IIcf/+ and NaPi-IIcf/f animals, respectively. The absence of NaPi-IIc in the kidneys of NaPi-IIcf/f mice did not affect the Na/Pi-cotransport activity in renal brush border membrane vesicles (BBMVs). Moreover, the expression of other renal Na/Pi-cotransporters, namely NaPi-IIa and Pit-2, remained unaffected. Similarly, the abundance of NaPi-IIb in intestinal BBM did not changed upon removal of NaPi-IIc. This suggests the absence of compensatory changes of other Na/Pi-cotransporters in NaPi-IIc depleted mice.
The urinary excretion of Pi and the concentration of Pi in plasma were normal upon depletion of NaPi-IIc in the kidney. Moreover, the circulating levels of the phosphaturic hormones PTH and FGF23 remained unchanged. The concentration of Ca 2+ in plasma and urine as well as circulating levels of 1,25(OH)2D3 also remained unchanged. Furthermore, the mRNA expression of the 1α-hydroxylase and 24-hydroxylase were comparable in NaPi-IIc+/+ and NaPi-IIcf/f mice.
The data that we obtained with the renal-specific and inducible NaPi-IIc deficient mice are only partially in agreement with observations reported in constitutive NaPi-IIc deficient mice. Thus, in constitutive NaPi-IIc depleted mice the urinary excretion and plasma Pi are normal, similar to our renal-specific model. However, the constitutive depletion of NaPi-IIc resulted in hypercalcemia and hypercalciuria as well as in increased 1,25(OH)2D3. Together these findings suggested that depletion of NaPi-IIc in some extra-renal tissues might explain the changes in Ca2+ homeostasis in the constitutive NaPi-IIc knockouts. Moreover, the absence of changes in Pi and Pi-related parameters in both the constitutive and renal- specific NaPi-IIc deficient models suggests that unlike in humans, NaPi-IIc has a minor role in the renal reabsorption of Pi in mice.
In conclusion, we have generated a renal-specific and inducible NaPi-IIc deficient mouse model. This study indicated that unlike in humans, the reabsorption of Pi by NaPi-IIc is minimal in mouse kidney. The inducible system (floxed NaPi-IIc: Cre recombinase) will allow us to further investigate the role of NaPi-IIc in different organs other than in the kidney.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Wagner Carsten Alexander
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:Unspecified
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2014
Deposited On:04 Apr 2019 08:35
Last Modified:15 Apr 2021 15:01
Number of Pages:106
OA Status:Green

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